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문제 정의
- 그러나, 상온추출함으로써 얻어지는 malonyl ginsenoside와 cation exchange resin을 사용함으로써 생성되는 prosapogenin은 TLC상에서는 관찰되나 RI 검출기를 사용하는 기존의 HPLC 분석조건에서는 7종의 주종 사포닌 (ginsenoside Rb1, b2, c, d, e, f, g1)을 제외하고는 전혀 분리가 되지 않음으로서 추출 및 분획방법에 따른 조사포닌 중 ginsenoside의 특성을 비교하기가 곤란하였다. 따라서 본 연구에서는 HPLC 컬럼은 NH2와 C18을, 이동상은 gradient 로서 CH3CN/H2O/isopropyl alcohol(isoPrOH) 과 CH3CN/KH2PO4/H2O를 병용하고, 검출기는 ELSD(evaporative light scattering detector)를 사용하여 분석한 결과, 추출 및 분획조건에 따라 각 인삼 조사포닌 중 ginsenoside의 조성이 현저한 차이가 있음을 보고하는 바이다.
제안 방법
- LC/MS에 의한 분석: 각 조사포닌 50mg을 MeOH 1mL에 용해하여 10μL씩 LC/MS(일본 JMS-LC Mate LC/MS system)에 주입하였다. 컬럼과 전개용매는 NH2 column을 이용한 HPLC 분석조건에서 사용한 gradient 조건과 동일하며 ionization mode는 negative FAB (fast atom bombardment), FAB energy는 4 kV, emission current는 10-20 mA, neutral gas는 Xe, matrix는 glycerol을 사용하였다.
- C18 column을 이용한 HPLC 분석: 각 조사포닌 1 mg을 1 mL의 50% MeOH에 용해하고 0.45μm nylon syringe filter로 여과한 후 C18 column(일본 YMC사,∅4.6×250mm, 5 μm)에 주입하고 gradient 용출조건으로 분석하였다. 즉 전개용매 A: 50 mM KH2PO4, B: 60% CH3CN/30 mM KH2PO4를 사용하였는데, B 용매의 농도는 초기 40%에서부터 최종 80%까지 80분간 직선적으로 상승시켰다.
대상 데이터
- 는 Fluka사 특급시약을 사용하였다. 인삼사포닌 성분의 표준 물질은 한국인삼연초연구원에서 분리한 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1 Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, 등 11 종을 분양받아 사용하였다.
- Gradient의 경우, 전개용매로서 A: CH3CN/ H2O/isoPrOH(16 : 1 : 3), B: CH3CN/H2O/isoPrOH(14 : 6 : 3)를 사용하였는데, B 용매의 농도는 초기 40%로부터 최종 70%까지 40분간 직선적으로 상승시켰다. 검출기는 ELSD(프랑스 SEDERE사, Model SEDEX 55), flow rate는 1.2mL/min이었다.
- 6×250mm, 5 μm)에 주입하고 gradient 용출조건으로 분석하였다. 즉 전개용매 A: 50 mM KH2PO4, B: 60% CH3CN/30 mM KH2PO4를 사용하였는데, B 용매의 농도는 초기 40%에서부터 최종 80%까지 80분간 직선적으로 상승시켰다. 검출기는 UV 203 nm에서 사용하였다.
- 즉 전개용매 A: 50 mM KH2PO4, B: 60% CH3CN/30 mM KH2PO4를 사용하였는데, B 용매의 농도는 초기 40%에서부터 최종 80%까지 80분간 직선적으로 상승시켰다. 검출기는 UV 203 nm에서 사용하였다.
- HPLC 용매로서 CH3CN, isoPrOH, n-BuOH는 미국 Fisher Scientific사 제품을, H2O는 독일 Merck사 제품을 사용하였고 KH2PO4는 Fluka사 특급시약을 사용하였다. 인삼사포닌 성분의 표준 물질은 한국인삼연초연구원에서 분리한 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1 Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, 등 11 종을 분양받아 사용하였다.
이론/모형
- 본 실험에서 사용한 인삼 조사포닌은 신 등(9)이 사용한 다섯가지 방법, 즉 고온 MeOH 추출/n-BuOH 분획법 (BuOH법), 고온 MeOH 추출/Diaion HP-20 흡착/MeOH 용출법 (HP-20 법), 고온 MeOH 추출/cation AG 50W 흡착/H2O 용출/n-BuOH 추출법 (AG 50W법), 상온 MeOH 추출/Diaion HP-20 흡착/MeOH 용출법(상온추출법) 및 EtOAc/n-BuOH 직접추출법으로 백삼으로부터 분리해 놓은 것을 사용하였다.
- 그 이유는 물리화학적 성질이 다양한 각종 ginsenoside를 isocratic 조건으로 동시에 분리하기 어렵기 때문이다. 따라서 박 등(12)이 사용한 방법에 준하여 이동상을 CH3CN/H2O/isoPrOH의 혼합비율을 변화시킨 gradient로 하고 검출기를 ELSD를 사용하여 HPLC 분석한 결과, Fig. 2a와 2b와 같은 결과를 얻었다. 그림에서 BuOH법 조사포닌 등을 비롯한 대부분의 조사포닌으로부터 ginsenoside Rh1 Rg1 및 Rf 등 저극성 ginsenoside가 완전하게 분리되는 것을 알 수 있다.
- 이상의 결과를 요약하면 Table 1과 같이 7종의 ginsenoside와 5종의 prosapogenin, 그리고 1 종의 chikuset-susaponin을 동정할 수 있었다. 이 중 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rh1 등 10종은 표준품과 비교하여 동정하였고 그외의 사포닌의 동정은 문헌(14)에 보고된 분자량을 참조하였다. Chikusetsusaponin LT8은 일본의 죽절인삼 잎에서 분리된 사포닌으로서 이번에 한국인삼 뿌리의 조사포닌으부터 LC/MS로 처음으로 동정하였으나 순수분리를 통한 확인이 요망된다.
성능/효과
- 인삼 조사포닌을 기존의 고온 MeOH 추출/n-BuOH 분획법 및 고온 MeOH 추출/Diaion HP-20 흡착/MeOH 용출법과 새로이 시도된 고온 MeOH 추출/cation AG 50W흡착/H2O 용출/n-BuOH 추출법 (AG 50W법), 상온 MeOH 추출/Diaion HP-20 흡착/MeOH 용출법(상온추출법)과 EtOAc/n-BuOH 직접 추출법으로 분리한 다음 기존의 HPLC/RI 방법으로 gin-senoside조성을 비교한 결과 EtOAc/n-BuOH 직접 추출법을 제외하고는 큰 차이가 없었으나 분리능과 감도가 우수한HPLC/ELSD방법을 사용한 결과, ginsenoside Rb2, Rf, Rg1 및 Rh1 등을 뚜렷이 식별할 수 있었고 추출 및 분획방법에따라 조사포닌간 ginsenoside의 현저한 조성차이를 볼 수 있었다. 특히 AG 50W법에 의해 분리된 조사포닌에서 뚜렷한 prosapogenin 피크를 볼 수 있었으며 LC/MS의 결과, ginse-noside Rb1, Rb2 등의 7종의 주종 사포닌 이외에도 5종의 prosapogenin과 1종의 chikusetsusaponin을 포함한 총 13종의 ginsenoside를 동정하였다.
- 상온 추출법 조사포닌의 경우도 BuOH법 조사포닌과 별다른 특징을 나타내지 않고 있었으며 별도로 분리되는 malonyl ginsenoside 피크는 볼 수 없었다. EtOAc/n-BuOH 직접추출에 의한 조사포닌의 경우는 ginsenoside Rg1과 Re가 상대적으로 높게 나타났다(Fig. lb).
- 그림에서 BuOH법 조사포닌 등을 비롯한 대부분의 조사포닌으로부터 ginsenoside Rh1 Rg1 및 Rf 등 저극성 ginsenoside가 완전하게 분리되는 것을 알 수 있다. 상온 추출법 조사포닌의 경우malonyl ginsenoside Rb1 Rb2, Rc 및 Rd 등이 상당량 함유되어 있으나 HPLC 분리패턴이 BuOH법 조사포닌과 유사한 것으로 보아 gradient를 사용한 본 분석조건에서도 대응하는 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 등과 분리되지 않았음을 알 수 있었다. 따라서 NH2 column으로는 이동상을 isocratic에서 gradient로 바꾸더라도 화학구조가 단지 malonyl group의 유무로서만 구별되는 사포닌의 상호분리가 어렵다고 판단되어 이들의 분리를 위해서는 NH2 대신에 C18column을, 이동상도 gradient를 하되 염을 사용하였다.
- AG 50W법 조사포닌의 경우 ginsenoside Rh1, Rg2 및 Rg3 위치에서 현저히 증가된 피크를 볼 수 있는데 이들은 표준품과 비교시 prosapogenin임을 알 수 있었다. 반면에 ginsenoside Rb1 Rb2, Rc, Rd 및 Re 등의 피크의 크기가 상대적으로 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었다. EtOAc/n-BuOH 직접 추출 사포닌의 경우 앞의 결과와 같이 ginsenoside Rg1과 Re가 상대적으로 높게 함유되어 있음을 뚜렷하게 알 수 있었다 (Fig.
- 반면에 ginsenoside Rb1 Rb2, Rc, Rd 및 Re 등의 피크의 크기가 상대적으로 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었다. EtOAc/n-BuOH 직접 추출 사포닌의 경우 앞의 결과와 같이 ginsenoside Rg1과 Re가 상대적으로 높게 함유되어 있음을 뚜렷하게 알 수 있었다 (Fig. 2b).
- 3B는 질량분석기 도입 직전에 연결된 UV 검출기로 동시에 기록된 chromatogram이다, HPLC column을 통과한 시료의 1/20이 질량분석기로 주입되므로 TIC에 나타난 바와 같이 피크의 크기가 작은 반면 이에 상응하는 UV chTomatogram은 앞에서 HPLC/ELSD에서 얻어진 chromatogram과 유사함을 알 수 있다. tR 5.46, 11.11, 14.37, 16.47 및 18.07 min에서 크게 나타난 피크들은 각각 m/z 637, 783, 781, 783 및 799를 분자량-l(M-l)로 나타냄으로서 각각 prosapogenin Rh1, Rg2, △20, Rg3 및 Rf임을 알 수 있었다. AG 50W법에 의해 조사포닌을 분리하는 과정에서 이와 같이 prosapogenin이 생성됨에 따라 상대적으로 감소된 피크들은 각각 ginsenoside Rg1(m/z 799), Re(m/z 945), Rd(m/z 945), Rc(m/z 1077), Rb2(m/z 1077) 및 Rb1(m/z 1107)으로 각각 동정할 수 있었다.
- 07 min에서 크게 나타난 피크들은 각각 m/z 637, 783, 781, 783 및 799를 분자량-l(M-l)로 나타냄으로서 각각 prosapogenin Rh1, Rg2, △20, Rg3 및 Rf임을 알 수 있었다. AG 50W법에 의해 조사포닌을 분리하는 과정에서 이와 같이 prosapogenin이 생성됨에 따라 상대적으로 감소된 피크들은 각각 ginsenoside Rg1(m/z 799), Re(m/z 945), Rd(m/z 945), Rc(m/z 1077), Rb2(m/z 1077) 및 Rb1(m/z 1107)으로 각각 동정할 수 있었다. 그 밖에 chikusetsusaponin LT8과 ginsenoside F3를 동정하였다.
- Hattori 등(13)은 Rb1 Rc, Rd, Re 및 Rg1을 LC/MS 로 동정하였으나 본 실험에서는 Rg2, Rg3 및 Rh1, 등을 추가로 동정하였다. 이상의 결과를 요약하면 Table 1과 같이 7종의 ginsenoside와 5종의 prosapogenin, 그리고 1 종의 chikuset-susaponin을 동정할 수 있었다. 이 중 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rh1 등 10종은 표준품과 비교하여 동정하였고 그외의 사포닌의 동정은 문헌(14)에 보고된 분자량을 참조하였다.
- Yamaguchi 등(15)은 ODS HPLC col-umn의 온도를 40℃로 하고, 이동상은 isocratic으로서 50 mM KH2PO4/30% CH3CN을 사용하여 malonyl ginsenoside를 분리하였으나 분리능이 떨어지는 것을 볼 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 성질이 유사한 C18 column을 사용하되 isocratic대신 gradient로 분석한 결과, 실온에서도 Fig. 4A와 같이 분리능이 매우 좋은 것을 알 수 있었다. 또한 상온 추출법 조사포닌을 알카리 처리한 다음 HPLC하여 처리 전과 비교한 결과 상온추출 사포닌에서는 malonyl ginsenoside Rb1, Rb2, Rc로 추정되는 피크를 볼 수 있으나 알카리 처리시 이들이 없어지고, ginsenoside Rb1, Rb2 및 Rc가 상대적으로 증가하는 것으로 보아 malonyl ginsenoside의 존재를 알 수 있었다(Fig.
- 4A와 같이 분리능이 매우 좋은 것을 알 수 있었다. 또한 상온 추출법 조사포닌을 알카리 처리한 다음 HPLC하여 처리 전과 비교한 결과 상온추출 사포닌에서는 malonyl ginsenoside Rb1, Rb2, Rc로 추정되는 피크를 볼 수 있으나 알카리 처리시 이들이 없어지고, ginsenoside Rb1, Rb2 및 Rc가 상대적으로 증가하는 것으로 보아 malonyl ginsenoside의 존재를 알 수 있었다(Fig. 4B).
- Malonyl ginsenoside는 가열처리시 소실되는 것으로 알려져있는데, 이를 확인하기 위하여 BuOH법 조사포닌과 상온 추출법 조사포닌을 위의 HPLC조건으로 비교한 결과 후자의 조사포닌 중에 존재하는 malonyl ginsenoside가 BuOH법 조사포닌 중에는 없음을 볼 수 있는데, 이는 70% MeOH 환류추출 과정에서 열에 약한 malonyl기가 떨어졌음을 나타낸다 (Fig. 5). Malonyl ginsenoside는 인삼 중에 0.
- 특히 AG 50W법에 의해 분리된 조사포닌에서 뚜렷한 prosapogenin 피크를 볼 수 있었으며 LC/MS의 결과, ginse-noside Rb1, Rb2 등의 7종의 주종 사포닌 이외에도 5종의 prosapogenin과 1종의 chikusetsusaponin을 포함한 총 13종의 ginsenoside를 동정하였다. 새로이 정립한 HPLC 분석조건, 즉 NH2 대신에 C18 column을 사용하고 KH2PO4/CH3CN gradient로 상온추출법으로 분리한 조사포닌을 분석한 결과, malonyl ginsenoside 피크를 용이하게 확인할 수 있었다.
- 특히 AG 50W법에 의해 분리된 조사포닌에서 뚜렷한 prosapogenin 피크를 볼 수 있었으며 LC/MS의 결과, ginse-noside Rb1, Rb2 등의 7종의 주종 사포닌 이외에도 5종의 prosapogenin과 1종의 chikusetsusaponin을 포함한 총 13종의 ginsenoside를 동정하였다. 새로이 정립한 HPLC 분석조건, 즉 NH2 대신에 C18 column을 사용하고 KH2PO4/CH3CN gradient로 상온추출법으로 분리한 조사포닌을 분석한 결과, malonyl ginsenoside 피크를 용이하게 확인할 수 있었다.
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