인과립구 콜로니 자극인자 제제인 HM10411와 필그라스팀의 정맥, 근육 및 피하 주사시 흰쥐와 마우스에서의 약물 동태 Pharmacokinetics of Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor (rhG-CSF) Following Intravenous, Intramuscular and Subcutaneous Administration of HM10411 and Filgrastim to Rats and Mice원문보기
The pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) following intravenous (i.v.), intramuscular (i.m.) and subcutaneous (s.c.) administration of HM1041l-lyo and HM10411-liq (lyophilized and liquid formulations of rhG-CSF, recently under development by Hanmi Phar...
The pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) following intravenous (i.v.), intramuscular (i.m.) and subcutaneous (s.c.) administration of HM1041l-lyo and HM10411-liq (lyophilized and liquid formulations of rhG-CSF, recently under development by Hanmi Pharmaceutical Company) were studied in rats, and compared with that of Filgrastim (conventional formulation of rhG-CSF on market). The plasma concentration of rhG-CSF was quantified using a specific ELISA. The pharmacokinetic parameters of rhG-CSF, after i.v., i.m. and s.c. administration of Filgrastim, HM1041l-lyo and HM1041l-liq to rats at a rhG-CSF dose of $10\;{\mu}g/kg$, were almost identical among the three formulations. No dose-dependency was observed in the pharmacokinetic parameters of rhG-CSF following i.v. administration in the dose range of $5{\sim}100\;{\mu}g/kg$. rhG-CSF, after i.v. administration of the three preparations at a dose of $10\;{\mu}g/kg$ to rats, was detected at low levels in all of the body tissues with highest tissue/plasma ratio of $0.46{\sim}0.51$ for the kidney at 30 min after the administration. The pharmacokinetics of rhG-CSF, after i.v. administration to mice at a dose of $10\;{\mu}g/kg$, were comparable among the three formulations. In conclusion, HM10411-lyo and HM10411-liq exhibited similar pharmacokinetics for rhG-CSF with Filgrastim regandless of animal species. Considering the fact that HM10411 series, contrary to Filgrastim, are proteins lacking a methionine residue, the methionine moiety in rhG-CSF molecule does not appear to influence the pharmacokinetics of the protein significantly.
The pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) following intravenous (i.v.), intramuscular (i.m.) and subcutaneous (s.c.) administration of HM1041l-lyo and HM10411-liq (lyophilized and liquid formulations of rhG-CSF, recently under development by Hanmi Pharmaceutical Company) were studied in rats, and compared with that of Filgrastim (conventional formulation of rhG-CSF on market). The plasma concentration of rhG-CSF was quantified using a specific ELISA. The pharmacokinetic parameters of rhG-CSF, after i.v., i.m. and s.c. administration of Filgrastim, HM1041l-lyo and HM1041l-liq to rats at a rhG-CSF dose of $10\;{\mu}g/kg$, were almost identical among the three formulations. No dose-dependency was observed in the pharmacokinetic parameters of rhG-CSF following i.v. administration in the dose range of $5{\sim}100\;{\mu}g/kg$. rhG-CSF, after i.v. administration of the three preparations at a dose of $10\;{\mu}g/kg$ to rats, was detected at low levels in all of the body tissues with highest tissue/plasma ratio of $0.46{\sim}0.51$ for the kidney at 30 min after the administration. The pharmacokinetics of rhG-CSF, after i.v. administration to mice at a dose of $10\;{\mu}g/kg$, were comparable among the three formulations. In conclusion, HM10411-lyo and HM10411-liq exhibited similar pharmacokinetics for rhG-CSF with Filgrastim regandless of animal species. Considering the fact that HM10411 series, contrary to Filgrastim, are proteins lacking a methionine residue, the methionine moiety in rhG-CSF molecule does not appear to influence the pharmacokinetics of the protein significantly.
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제안 방법
5, 2, 8시간에 각각 실혈 치사시켰다. 간, 폐, 신장, 비장, 심장 및 근육을 적출하여 적출한 조직무게의 4배에 해당하는 인산염 완충액(pH 7.4)을 가한 후 homegenizerfUltra-Ibirax T75, Janke & Kunkel, Ger- many)로 13,500 rpm 이상으로 homogenize 하였다. Homogenize한 액을 10,000 g에서 2분간 원심 분리한 후 얻은 상층액을 정량 전까지 -20℃에 냉동 보관하였다.
흰쥐의 대퇴 동맥에 미리 삽입한 cannula로부터 약물 투여 전 및 투여 후 5, 15, 30분 및 1, 2, 4, 6 및 8시간에 혈액 250μg씩을 채혈하였고 혈액응고를 막기 위하여 20units/ml의 heparin(생리식염수액) 용액으로 튜브에 남아있는 혈액을 완전히 동맥 속으로 주입하였다. 마우스 실험에서는 3제제를 10μg/kg의 용량으로 꼬리 정맥 내에 투여한 후 안저 (orbital plexus)로 부터 채혈하였다. 마우스 실험에서의 채혈시간 및 채혈량은 흰쥐실험에서와 같게 하였고, 채취한 혈액은 즉시 10,000 g에서 5분간 원심분리한 후 혈장 100μl를 취하여 정량시까지 -20℃에 냉동 보관하였으며, 혈장 중 rhG -CSF의 농도는 Quantikine kit™를 사용하여 정량하였다.
마우스 실험에서는 3제제를 10μg/kg의 용량으로 꼬리 정맥 내에 투여한 후 안저 (orbital plexus)로 부터 채혈하였다. 마우스 실험에서의 채혈시간 및 채혈량은 흰쥐실험에서와 같게 하였고, 채취한 혈액은 즉시 10,000 g에서 5분간 원심분리한 후 혈장 100μl를 취하여 정량시까지 -20℃에 냉동 보관하였으며, 혈장 중 rhG -CSF의 농도는 Quantikine kit™를 사용하여 정량하였다.
본 연구에서는 기존의 rhG-CSF와는 다른 숙주-벡터계를 이용한 유전자 재조합 빙법으로 제조함으로써 methionine 잔기가 없는 rhG-CSF인 HM10411를 동결 건조한 제품(HM 10411-lyo)과 액제(HM10411-liq)에 대하여 흰쥐와 마우스에서의 약물동태 파라미터를 측정하여 기존의 rhG-CSF인 Filgrastim(methionine잔기 함유)의 경우와 비교하였다.
약물동태로는 투여경로(정맥주사, 피하주사, 근육주사) 및 투여량에 대한 혈중 및 주요 조직 중 농도를 측정하여 3제제(HM10411-lyo, HM10411-liq, Filgrastim)간의 차이 유무를 검토하였다.
c로 흰쥐 6마리씩에게 투여하였다. 용량 의존성을 관찰하기 위하여서는 따로 3제제를 5,100μg/kg의 용량으로 흰쥐 6마리에게 각각 정맥 투여하였다. 정맥투여 시는 횔줘를 ketamine(50μg/kg)을 복강 주사하여 마취한 후 대퇴정맥에 polyethylene tube를 삽입하고, 흰쥐가 마취에서 완쳔히 회복된 후 튜브를 통하여 약물을 투입하고 생리식염수로 튜브에 남아있는 약물을 완전히 흰쥐의 정맥 속으로 주입하였다.
정맥투여 시는 횔줘를 ketamine(50μg/kg)을 복강 주사하여 마취한 후 대퇴정맥에 polyethylene tube를 삽입하고, 흰쥐가 마취에서 완쳔히 회복된 후 튜브를 통하여 약물을 투입하고 생리식염수로 튜브에 남아있는 약물을 완전히 흰쥐의 정맥 속으로 주입하였다. 정맥 근육 및 피하 주사시는 흰쥐의 대퇴근육 및 피하에 직접 주사하였다. 흰쥐의 대퇴 동맥에 미리 삽입한 cannula로부터 약물 투여 전 및 투여 후 5, 15, 30분 및 1, 2, 4, 6 및 8시간에 혈액 250μg씩을 채혈하였고 혈액응고를 막기 위하여 20units/ml의 heparin(생리식염수액) 용액으로 튜브에 남아있는 혈액을 완전히 동맥 속으로 주입하였다.
용량 의존성을 관찰하기 위하여서는 따로 3제제를 5,100μg/kg의 용량으로 흰쥐 6마리에게 각각 정맥 투여하였다. 정맥투여 시는 횔줘를 ketamine(50μg/kg)을 복강 주사하여 마취한 후 대퇴정맥에 polyethylene tube를 삽입하고, 흰쥐가 마취에서 완쳔히 회복된 후 튜브를 통하여 약물을 투입하고 생리식염수로 튜브에 남아있는 약물을 완전히 흰쥐의 정맥 속으로 주입하였다. 정맥 근육 및 피하 주사시는 흰쥐의 대퇴근육 및 피하에 직접 주사하였다.
투여경로별 혈장 중 rhG-CSF 농도의 차이를 살펴보기 위하여 3제제를 각 10 μg/kg의 용량으로 각각 i.v., i.m. 및 s.c로 흰쥐 6마리씩에게 투여하였다. 용량 의존성을 관찰하기 위하여서는 따로 3제제를 5,100μg/kg의 용량으로 흰쥐 6마리에게 각각 정맥 투여하였다.
흰쥐에 3제제를 각 10μg/kg의 용량으로 카테터를 통하여 대퇴정맥에 주사한 다음 0.5, 2, 8시간에 각각 실혈 치사시켰다. 간, 폐, 신장, 비장, 심장 및 근육을 적출하여 적출한 조직무게의 4배에 해당하는 인산염 완충액(pH 7.
정맥 근육 및 피하 주사시는 흰쥐의 대퇴근육 및 피하에 직접 주사하였다. 흰쥐의 대퇴 동맥에 미리 삽입한 cannula로부터 약물 투여 전 및 투여 후 5, 15, 30분 및 1, 2, 4, 6 및 8시간에 혈액 250μg씩을 채혈하였고 혈액응고를 막기 위하여 20units/ml의 heparin(생리식염수액) 용액으로 튜브에 남아있는 혈액을 완전히 동맥 속으로 주입하였다. 마우스 실험에서는 3제제를 10μg/kg의 용량으로 꼬리 정맥 내에 투여한 후 안저 (orbital plexus)로 부터 채혈하였다.
대상 데이터
rhG-CSF의 정량에 사용한 ELISA kiKQuantikine™)는 R&D System(Mckinley Place N.E. Minneapolis, MI, U.S.A.)으로부터, 흰쥐 실험에 사용한 polyethylene tube(PE-50)는 Clay Adams(Parsippany, NY; U.S.A.)로 부터 구입하였다.
웅성 Sprague-Dawley 흰쥐(240~300g의 7~8주령) 및 ICR 마우스(체중 28~32g의 6주령)는 대한실험동물센터(주)에서 분양 받아 사용하였으며, 실험 전 1주일 동안 서울대학교 약학대학 동물실험 연구동에서 온도 22±2℃; 습도 55±5℃로 09:00~21:00까지 조명시킨 상태에서 물과 사료를 자유롭게 섭취하도록 사육하였다. 사료는 autoclavable rodent laboratory chow 5010(Agibrands Puna Korea, Inc)를 사용하였다.
한미약품 연구소에서 생산한 HM10411 동결건조제품(HM10411-lyo), 액제제품(HM10411-liq)과 Filgrastim(제일약품, Korea)을 주사용 증류수에 희석하여 사용하였다. rhG-CSF의 정량에 사용한 ELISA kiKQuantikine™)는 R&D System(Mckinley Place N.
데이터처리
3제제로부터 얻은 체내동태 파라미터와 조직에 분포된 양은 SPSS프로그램(version 9.0, SPSS Inc., Chicago, IL, U.S.A.)을 사용하여 ANOVA로 통계처리하였으며, 유의수준은 p<0.05으로 판단하였다.
rhG-CSF의 체내동태 파라미터는 WinNonlin® 프로그램(version 1.1 Scientific Consulting Inc., Apex, NC, U.S.A.)을 사용하여 구하였다. 소실속도정수(β)는 log 혈장농도-시간곡선의 직선부분을 직선 회귀하여 구하였고, 시간 0에서 무한대까지 rhG-CSF의 혈장 중 농도-시간 곡선하면적(AUC) 및 혈장 중 약물농도 모멘트-시간 곡선(AUWC)는 사다리꼴 공식에 의해 구하였다.
이론/모형
)을 사용하여 구하였다. 소실속도정수(β)는 log 혈장농도-시간곡선의 직선부분을 직선 회귀하여 구하였고, 시간 0에서 무한대까지 rhG-CSF의 혈장 중 농도-시간 곡선하면적(AUC) 및 혈장 중 약물농도 모멘트-시간 곡선(AUWC)는 사다리꼴 공식에 의해 구하였다. 정맥주사 후 전신 클리어런스(CL), 평균 체류시간(MRT), 정상상태에서의 겉보기 분포용적(VSS) 및 생체이용률(F)는 다음 식에 의하여 구하였다8,9).
혈장 중 rhG-CSF의 농도는 Quantikine kit™에 포함되어 있는 매뉴얼 방법에 따라 정량하였다. 즉, Quantikine kit에 포함된 microtiter plate에 시료 즉, 혈장 상층액 또는 조직 호모지네이트상층액 100μl 및 RD1A assay diluent 100μl를 넣은 다음 2시간 동안 방치하였다.
성능/효과
또한 3제제를 마우스에게 10μg/kg 정맥 투여하였을 때도 흰쥐에 투여하였을 때와 혈장농도-시간추이는 비슷하였으며, 3제제 간의 차이도 없었다. 따라서 한미약품(주) 연구소에서 제조한 HM10411-lyo와 HM10411-liq는 Filgrastim과 약물동태가 비슷하다고 결론 지을 수 있었다. Filgrastim과 달리 HM 10411-lyo와 HM10411-liq에는 methionine잔기가 없다는 점을 고려할 때 methionine잔기는 rhG-CSF의 체내동태에 영향을 미치지 않은 것으로 생각되었다.
조직 중 농도는 실험한 모든 조직에서 3 제제 간의 차이 없이 투여 후 30분에서 2시간 및 8시간에 비해 최고치를 나타냈으며, 이후 신속히 감소하였다. 모든 조직에서 조직/혈장 중 농도(T/P)비는 1보다 작게 나타났는데, 이는 rhG-CSF의 조직친화력이 약하다는 것을 나타내며, 이는 Filgrastim과 HM10411 의 Vss 값이 적게 나타난 결과 (Table Ⅱ)와도 일치한다. Filgrastim, HM10411-lyo, HM10411-liq 투여 30분 후 신장에서의 T/P비는 0.
문헌을 살펴보면, rhG-CSF 1, 5, 10 및 100μg/kg을 흰쥐에 정맥 투여하였을 때t1/2는 용량의존성을, Vss는 용량 비의존성을 나타낸다고 보고된 바도 있고12), 모든 약물동태 파라미터 가용량 비의존적으로 나타난다고 보고된 바도 있다10,17). 본 연구에서는 3제제의 체내동태는 5-100 용량 범위에서 모두 용량 비의존적이었다.
조직분포 결과는 Table Ⅲ과 같다. 조직 중 농도는 실험한 모든 조직에서 3 제제 간의 차이 없이 투여 후 30분에서 2시간 및 8시간에 비해 최고치를 나타냈으며, 이후 신속히 감소하였다. 모든 조직에서 조직/혈장 중 농도(T/P)비는 1보다 작게 나타났는데, 이는 rhG-CSF의 조직친화력이 약하다는 것을 나타내며, 이는 Filgrastim과 HM10411 의 Vss 값이 적게 나타난 결과 (Table Ⅱ)와도 일치한다.
3제제는 비슷한 혈장농도-시간 추이를 보였으며, 따라서 약물동태 파라미터도 비슷하였다. 피하 및 근육 주사시 혈장농도는 신속히 증가하여 2시간에 최고혈장중농도에 도달하였고, 이후 정맥 투여에 비해 서서히 감소하였다. Filgrastim, HM10411-lyo와 HM10411-liq의 생체이용률은 피하 주사시 각각 31.
한미약품에서 개발한 HM10411-lyo, HM10411-liq을 기존 제품인 Filgrastim과 약물동태를 비교하였을 때, 흰쥐에 10μg/kg을 정맥, 피하 및 근육 주사시 약물동태 파라미터와 생체이용률에 있어서 3제제 간에 차이는 없었고, 5, 10, 100μg/kg 정맥투여 시 용량의존성도 없었으며, 3제제 간 차이도 없었다. 그리고, 10μg/kg 정맥투여 시 조직분포도 3제제가 비슷한 양상을 보였으며, 신장에 제일 많이 분포하였다.
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