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문제 정의
- 배설(sequestration)과정을 분리하여 in vivo 레벨에서 평가하는 방법을 검토하였다. In vivo 실험으로는 급속 정맥주사 및 등속주입의 실험을 하였으며, 약물의 간내 이행을 in vivo 레벨에서 해석하는 방법의 확립을 목표로 하였다.
가설 설정
- 4 인산염완충액을 사용하여 20% 균질액으로 만든 다음 정량에 사용하였다. 담즙의 비중은 1로 가정하고 중량을 측정하여 담즙의 체적을 계산하였다.
제안 방법
- ANS를 급속 정맥주사한 후 1분에서의 간장 중 농도를 측정하여 계산한 간 내 유입약물량(Xjivgn血)으로 부터, 간 회수율(Rh, %)을 다음 식과 같이 산출하였다.
- ANS를 등속 주입하여 정상 상태에 도달한 시점에서 혈장 중농도 (Cp, ss), 간장 중 농도(Cgss), 및 담즙배설 속도 (Vbile, ss) 를측정하였다. 이로부터 혈장 중 농도를 기준으로 한 담즙배설 클리어런스(CLbmw) 및 간장 중 농도를 기준으로 한 담관 막 투과 클리어런스(CLexcretion>를 각각 다음 식으로부터 산출하였다.
- ANS의 주입 속도를 변화시켜(0.2-1.6|imol/min/kg), 정맥 내로 등속주입한 후 혈장 중 농도, 담즙 중 농도 및 간중 농도를 측정하였다. 혈장 중 농도 및 담즙 배설 속도는 대부분 분포 후상 반감기(13.
- 999)를 보였다. 간 조직 중 ANS 농도 정량을 위해서는 간 20% 균질액 200μl에 메탄올 3 ml를 가한 다음, 혈장과 같은 방법으로 분석하였다.
- 간내이행 및 담즙 배설 과정을 검토하였다. 특히, 간 내 유입 (influx), 배출(efflux) 및 대사.
- 삽관하였다. 담즙의 채취를 위해서는 복부를 개복한 다음, 폴리에틸렌 튜브(PE-10>를 담관에 삽관하고, 복부를 다시 봉합하였다. 흰 쥐가 마취로부터 회복된 후에 ANS 의 주입 속도를 0.
- 배설(sequestration) 과정의 고유 클리어런스(permeabilitysurface area product)# 각각 나타낸다. 따라서, 상기의 급속 정맥주사 및 등속주입의 실험 결과로부터 산출한 파라미터를 사용하여 PSefflux 값을 산출하였다. 즉, Kp,ss 값은 등속주입의 정상 상태에서 산출한 값 1.
- 6 μmol/min/kg) 주입 등 일부에서 실험적 오차를 보였다. 따라서, 정상 상태의 혈장중 농도 및 간중 농도의 실험치는 실험적 오차를 줄이고, 정상 상태에 도달 한 후의 정확한 값을 반영하는 3시간대의 값을 사용하였다(Figure 3, 4(A)). 누적 담즙 배설량은 각 투여량에서 지속적으로 증가되는 경향을 나타내었다(Figure 4(B)).
- 특히, 간 내 유입 (influx), 배출(efflux) 및 대사. 배설(sequestration)과정을 분리하여 in vivo 레벨에서 평가하는 방법을 검토하였다. In vivo 실험으로는 급속 정맥주사 및 등속주입의 실험을 하였으며, 약물의 간내 이행을 in vivo 레벨에서 해석하는 방법의 확립을 목표로 하였다.
- 비결합형 ANS를 기준으로 in vivo에서의 간 내 유입에 관한 고유 클리어런스(permeability-surface area product, PSupflux)를다음과 같이 산출하였다. Well-stirred 모델(venous equilibrium 모델)28)에 따르면, CLuptake는 다음과 같은 식으로 나타낼 수 있다.
- 생체시료 중 ANS의 정량은 저자 등3,4)이 보고한 방법을 개량하여 사용하였으며, 그 조건은 다음과 같다. 즉, 혈장 및 담즙 시료 각각 50μl에 메탄올 3 ml 가한 다음 추출, 원심분리(3000rpm, 15분, 4℃하였다.
- 2, L6 μmol/kg로 변화시키며 각각 등속으로 주입하였다. 약물 투여 후 혈장 및 담즙을 경시적으로 채취하였다. 정상 상태에 도달했을 때 전혈액을 탈혈시켜 급속치사시킨 다음 간 약 1 g을 적출하였다.
- 흰 쥐가 마취로부터 회복된 후에 ANS 를 생리식염수에 녹여 정맥투여(30μmol/kg)하였다. 약물투여 후 혈액을 대퇴 동맥으로부터 경시적으로 채취하였다. 채혈 시간은 20, 40초 및 1, 3, 5, 10, 15분에 혈액 200 W를 마이크로튜브에 받아서 탁상용 원심분리기를 사용하여 원심분리 후 얻어진 혈장 50μl를 정량에 사용하였다.
- 정맥주사한 후 초기 시간, 즉 1분 이내의 시간대에서 ANS 의 혈장 중 소실 및 간장으로의 유입(uptake)을 측정하였다. 초기시간대에서는 ANS의 간세포 내에서 혈액으로의 배출 (efflux) 및 담즙배설, 또한 간장 내에서의 대사분율을 무시할 수 있기 때문이다.
- 정상 상태에서 혈장 중 농도, 간중 농도 및 담즙 배설속도를 측정하여 담즙배설 클리어런스(CLbiliary) 및 담관막 투과 클리어런스(CLexerecion)를 산출하였다(Figure 6, 7).혈장중 농도를 기준으로 한 CLbiliary는 혈장 중 농도의 증가에 의해 큰 차이를 보이지 않았으나, 간중 농도를 기준으로한 CLexcretion은 ANS의 간중 농도가 증가함에 따라 전형적인 MichaeHs- Menten식의 포화현상을 나타내었다.
- 주입 속도를 변화시키면서 ANS를 정맥 내로 주입하여 혈장 중 농도를 정상 상태 (steady-state)로 일정하게 유지시켰다. 정맥내 주입속도(k0)는 다음식에 따라 산출하였다.
- 사용하였으며, 그 조건은 다음과 같다. 즉, 혈장 및 담즙 시료 각각 50μl에 메탄올 3 ml 가한 다음 추출, 원심분리(3000rpm, 15분, 4℃하였다. 상징액을 취하여 형광 광도계로 정량하였으며, 여기(excitation) 파장을 390 nm, 형광 (emission) 파장을 480 nm, 여기 slit width를 10 nm, 형광 slit width를 5nm 로 고정시켜 사용하였다.
- 약물투여 후 혈액을 대퇴 동맥으로부터 경시적으로 채취하였다. 채혈 시간은 20, 40초 및 1, 3, 5, 10, 15분에 혈액 200 W를 마이크로튜브에 받아서 탁상용 원심분리기를 사용하여 원심분리 후 얻어진 혈장 50μl를 정량에 사용하였다. 간 조직 중의 ANS 정량을 위해서는 일정 시간에 탈혈시켜 급속 치사시킨 다음, 간 약 1 g을 적출하였다.
- A)를 삽관하였다. 흰 쥐가 마취로부터 회복된 후에 ANS 를 생리식염수에 녹여 정맥투여(30μmol/kg)하였다. 약물투여 후 혈액을 대퇴 동맥으로부터 경시적으로 채취하였다.
- 담즙의 채취를 위해서는 복부를 개복한 다음, 폴리에틸렌 튜브(PE-10>를 담관에 삽관하고, 복부를 다시 봉합하였다. 흰 쥐가 마취로부터 회복된 후에 ANS 의 주입 속도를 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, L6 μmol/kg로 변화시키며 각각 등속으로 주입하였다. 약물 투여 후 혈장 및 담즙을 경시적으로 채취하였다.
- 흰쥐를 에텔로 가볍게 마취시킨 후 좌측 대퇴부 동맥 및 정맥에 폴리에틸렌 튜브(PE-50, Intramedic, Clay Adams, U.S.A)를 삽관하였다. 흰 쥐가 마취로부터 회복된 후에 ANS 를 생리식염수에 녹여 정맥투여(30μmol/kg)하였다.
- 흰쥐를 에텔로 가볍게 마취시킨 후 좌측 대퇴부 동맥 및 정맥에 폴리에틸렌 튜브(PE-50, Intramedic, Clay Adams, U.S.A)를 삽관하였다. 흰 쥐가 마취로부터 회복된 후에 ANS 를 생리식염수에 녹여 정맥투여(30μmol/kg)하였다.
대상 데이터
- 1 -Anilino-8-naphthalene sulfonate sodium salt(ANS) (Tokyo Kasei Kogyo Co., Japan), diethyl ether(ledia Co., INC., U.S.A.), methanol(Fisher Scientific Co., Ltd., U.S.A.) 및 heparin(Upjohn., No. 268-5, U.S.A.)을 사용하였으며, 기타 시약은 HPLC급 또는 특급을 사용하였다.
- 기기로는 형광광도계(MPF4, Hitachi Co., Japan), 등속주입 기 (Harvard apparatus, USA), pH 미터 (M520, Orion Research Inc., U.S.A.), 저온 원심분리기 (GS-6KR, Beckman Industries, U.S.A.), 탁상용 원심분리기 (Microfuge E, Beckman Industries, U.S.A.), 냉동고(OPR-DFU-250, Operon ENG. Co., 한국), 초음파 세척기 (M2010, Jinwoo ENG. CO., 한국), 진탕기(Eurostar, IKA-Labortechnic Co., Germany), 호모게나이져 (Ultra-Tuna嵌 T25, IKA-Labortechnic Co., Germany) 등을 사용하였다.
- 실험동물로는 숫흰쥐(200-250g)를 주식회사 샘 타코(경기도, 안성)로부터 구입하여 약학대학 동물사육장에서 항온, 항습 조건 하에서 사육한 후 사용하였다.
- 이 연구에서는 ANS를 모델 물질로 사용하여 약물의. 간내이행 및 담즙 배설 과정을 검토하였다.
- 정상 상태에 도달했을 때 전혈액을 탈혈시켜 급속치사시킨 다음 간 약 1 g을 적출하였다. 혈액과 담즙은 마이크로 튜브에 받아서 탁상용 원심분리기를 사용하여 원심분리한 후 각각 50 W를 정량에 사용하였다. 적출한 간은 pH 7.
이론/모형
- 59시간대에서 거의 정상 상태에 도달되었으나, 정상 상태의 혈장 중 농도 및 간중농도의 실험치는 3시간대의 값을 사용하였다. 간중 농도를 기준으로 한 CLeEone ANS의 간중 농도가 증가함에 따라 전형적인 Michaelis-Menten식의 포화현상을 나타내었다. 또한, 간조직 내 비결합형 ANS 농도에 대한 PSexcretione 0.
- 따라서, 비결합형 ANS를 기준으로 in vivo에서의 간내 유입에 관한 고유 클리어런스(permeability-surface area product, PSinflux)를 (6)식에 따라 산출하였다. fp 및 R 24) 따라서, 생체 내에 미량 존재하는 형광성대사체가 모 약물인 ANS의 형광광도에 미치는 영향은 무시할 수 있다. 본 실험에서는 저자 등3)이 보고한 차스펙트럼의 원리를 이용하여 이를 보정하였다.
성능/효과
- 1. ANS 30Rmole/kg을 정맥 투여한 후 1분 이내의 초기시간대에서 혈장 중 소실반 감기(&)는 0.102분이었으며, 간중농도를 측정하여 integration plot에 의해 산출한 in vivo 간 내 유입 클리어런스(CLuptake)는 0.10 ml/min/g liver이었다. 또한, 혈장내 비결합형 ANS를 기준으로 in vivo에서의 간 내 유입에 관한 고유 클리어런스(PSmmx)는 11.
- 2. ANS의 주입 속도를 변화시켜 (0.2-1.6jimol/min/kg) 정맥 내로 등 속주입한 후 혈장 중 농도 및 담즙 배설 속도는 대부분 분포후 상 반감기(13.6분)의 7배인 1.59시간대에서 거의 정상 상태에 도달되었으나, 정상 상태의 혈장 중 농도 및 간중농도의 실험치는 3시간대의 값을 사용하였다. 간중 농도를 기준으로 한 CLeEone ANS의 간중 농도가 증가함에 따라 전형적인 Michaelis-Menten식의 포화현상을 나타내었다.
- 3,4)ANS는 높은 형광성을 나타내어 생체중 미량 분석이 가능하다는 장점을 지니고 있다. 저자 등3) 은 혈중으로부터 간으로만 이행되는 속도론적 모델에 의해 ANS의 체내 동태를 해석하여 보고한 바 있다.
- 3.급속정맥주사 및 등속주입의 실험 결과로부터 산출한 파라미터를 사용하여 PSefflux 값을 산출한 결과, 3.71 ml/min/ g liver의 값을 나타내었으며, 양호한 in vitro-in vivo 상관성을 보였다.
- 또한, 혈중으로부터 ANS의 소실을 수송계에 의한 이행 및 간 세포질 내 단백결합의 두 요인으로 분류하여 각각의 기여율을 보고한바 있다.4)즉, ANS가 혈중으로부터 효율성 높게 간내로 이행되는 것은 수송계의 기여뿐만 아니라 간세포질내의 강한 단백결합도 기여하는 것이 밝혀졌다. 한편, 간내로 이행된 ANS는 대부분 비형광성대사체로 대사되는 것으로 생각된다.
- ANS 30 μmole/kg을 정맥 투여한 후 혈장중 농도는 분포 전상에서 급격한 감소를 보였으며, 분포 후 상에서는 서서히 감소되었다. 간중 농도는 1분까지 증가하다가 이후 혈장 중소 실과 평행하게 감소되었다(Figure 1).
- 간중 농도를 기준으로 한 CLeEone ANS의 간중 농도가 증가함에 따라 전형적인 Michaelis-Menten식의 포화현상을 나타내었다. 또한, 간조직 내 비결합형 ANS 농도에 대한 PSexcretione 0.0165 ml/min/g liver의 값을 보였으며, ANS의 대사고유 클리어런스(CLjoint=3.30 ml/min/g liver)에 비해 무시할 수 있을 정도로 작은 값을 나타내었다.
- 10 ml/min/g liver이었다. 또한, 혈장내 비결합형 ANS를 기준으로 in vivo에서의 간 내 유입에 관한 고유 클리어런스(PSmmx)는 11.25 ml/min/g liver 의 값을 보였으며, 양호한 in vitro-in vivo 상관성을 나타내었다.
- 1 gM의 값이 얻어졌다(unpublished data). 이들 파라미터를 사용하여 그 비율(Vg/KnJ로 부터 산출한 in vitm 레벨에서의 PSinflux.vitro는 13.7 ml/min/g liver 의 값을 보였으며, 본 실험의 in vivo 정맥주사 결과와 유사 (comparable)한 값을 나타내었다. 즉, 양호한 in vitro-in vivo 상관성을 나타내었으며, 본 실험에서 단회 급속 정맥주사에 의해 간내 유입 클리어런스를 구하는 실험법의 타당성을 보.
- data). 이들 파라미터를 사용하여 그 비율(Vmax/Km) 로부터 산출한 in vitro 레벨에서의 PSeaiux, vivo는 7.32 ml/ min/g liver의 값을 보였으며, 본 실험의 in vivo 정맥주사 및 등속 주입의 결과로부터 계산한 추정치와 유사(comparable) 한 값을 나타내었다. 즉, 양호한 in vitro-in vivo 상관성을 나타내었으며, 본 실험의 in vivo 레벨에서 간 내 유입 (uptake), 배출(efflux) 및 대사.
- 정상 상태에서 혈장 중 농도에 비해 간중 농도가 162.0배 높은 값을 보였다. 이는 ANS가 농도구 배를 역행하여 농축적으로 간조직 내로 이행되는 것을 나타내주는 결과이다.
- 산출하였다. 즉, 급속 정맥주사후 1분 이내의 ANS 혈장 중 소실은 하나의 지수함수로 감소되었다. 따라서, 초기 시간대에서는 1-컴파트먼트 모델을 적용할 수 있다.
- 7 ml/min/g liver 의 값을 보였으며, 본 실험의 in vivo 정맥주사 결과와 유사 (comparable)한 값을 나타내었다. 즉, 양호한 in vitro-in vivo 상관성을 나타내었으며, 본 실험에서 단회 급속 정맥주사에 의해 간내 유입 클리어런스를 구하는 실험법의 타당성을 보.여주고 있다.
- 32 ml/ min/g liver의 값을 보였으며, 본 실험의 in vivo 정맥주사 및 등속 주입의 결과로부터 계산한 추정치와 유사(comparable) 한 값을 나타내었다. 즉, 양호한 in vitro-in vivo 상관성을 나타내었으며, 본 실험의 in vivo 레벨에서 간 내 유입 (uptake), 배출(efflux) 및 대사. 담즙 배설(sequestration) 과정의 클리어런스를 해석하는 실험법의 타당성을 보여주고 있다.
- 산출하였다(Figure 6, 7).혈장중 농도를 기준으로 한 CLbiliary는 혈장 중 농도의 증가에 의해 큰 차이를 보이지 않았으나, 간중 농도를 기준으로한 CLexcretion은 ANS의 간중 농도가 증가함에 따라 전형적인 MichaeHs- Menten식의 포화현상을 나타내었다. 이러한 결과는 간세포 내에서 모세담관막으로 투과되는 과정에 특수한 수송계가 관여한다는 가능성을 보여주는 결과이다.
후속연구
- 담즙 배설 (sequestration)과정을 분리 . 평가하는 실험법을 제시한 본 연구결과는 in vivo 레벨에서 약물의 간내 이행 및 담즙배설을 해석하는데 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
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