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문제 정의
- 99 μg/μl의 농도에서 50%의 저해를 보였다고 보고한 바 있다. 본 biopolymer 역시이보다 뛰어난 ACE 저해 효과를 보여 새로운 ACE 저해물질로의 가능성을 시사하였다. 또한 Suh 등19)이 식품에 존재하는 ACE 저해물질은 기존 상품화된 혈압강화제와 비교했을 때 비교적 낮은 활성을 나타낸다하더라도 대량으로 섭취하는 식품에존재한다는 점에서 그 유용성을 제안한 바 있다.
- 이에 본 연구에서는 polypeptide 계열인 본 biopolymer의 장내 흡수 지연 효과와 효소저해능 등의 기능성을 조사하여 식품, 의약품 및 화장품 공업에 응용할 수 있는 소재로서 검증은물론 산업화를 위한 기초 자료를 마련하고자 하였다.
가설 설정
- Glucose의 흡수 지연 효과. Biopolymer의 장관 내 흡수 지연 효과는 유리상태의 잉ucose는 투석막을 그대로 통과 하지만고분자 물질에 흡착된 glucose는 투석막을 통과하지 못할 것이라는 가정 하에 투석막을 이용하여 투석 내액의 glucose가 투석 외액으로 빠져 나오는 원리를 이용하여 실시하였다.3) 이 때투석막은 생체 내 장막의 투과 조건과 유사한 것으로 molecular weight cut-off가 비교적 낮은 투석막(Sigma D7884: M.
제안 방법
- 즉, 균주는 Bacillus coagulans CE-74를 실험에 사용하였으며 nutrient broth에서 예비 배양한 후 증자한 대두에 1% 되도록 접종하여 72 시간 배양하였다. Biopolymer의 분리는 전보에서의 방법에 준하여 배양물에 증류수를 가하여 진탕 추출하고 9,000xg로 원심분리하여 균체 및 불용성물질을 제거하였다. 상징액에 동량부피의 ethanol을 첨가하여 교반봉으로 교반하는 조작을 수 회 반복하였다.
- Bile acid의 흡수 지연 효과. Biopolymer의 장관 내 bile acid의 흡수지연 효과는 투석막(Sigma D7884: M.W. C.O.> 1, 200)을 이용하여 투석 내액의 bile acid가 투석 외액으로 빠져 나오는 원리를 이용하였다.3) 투석막 내부에 시료를 넣고 0.
- Glucose의 투과는 bile acid보다 비교적 빨리 이루어졌으며 그 이유는 glucose의 분자량이 bile acid보다 작기 때문으로사료된다. Glucose 투과율은 초기에는 급속히 이루어지나 투석시간이 경과할수록 투과율은 떨어졌으며 흡수 지연 효과가 우수하다고 보고7)된 바 있는 citrus pectin, CM-cellulose와 흡수지연 효과를 비교하여 glucose의 흡수 지연 효과를 판단하였다. 투석 30 분 경과 후 citrus pectin 46%, biopolymer 44%, CM-cellulose는 6%의 fucose 흡수 지연 효과를 보여 biopolymer는 citrus pectin와 거의 같은 수준의 효과를 보였다 (Fig 4).
- 0) lOOml를 첨가한 후 37℃ 수욕조에서 용기가 잠기게 하여 100rpm으로 교반하였다. 일정한 시간 간격으로 투석 외액 1 m/씩을 취하여 taurocholic acid 함량을 분석하였다. Bile acid 흡수 억제 지수는 아래와 같이 계산하였으며 Bile acid 함량 분석은 Boyd 등4)의 방법에 따라 bile acid 용액 1 m/에 70% H2SQ4 용액 5ml를 더하고 5분 후에 0.
- 1% sodium azide 용액 10ml를 첨가한 후 37℃ 수욕조에서 용기가 잠기게 하여 lOOrpm으로 교반시켰다. 일정한 시간 간격으로 투석 외액 1m/ 씩을 취하여 glucose 함량을 분석하였다. Glucose 흡수 억제 지수는 아래와 같이 계산하였다.
대상 데이터
- Biopolymer의 장관 내 흡수 지연 효과는 유리상태의 잉ucose는 투석막을 그대로 통과 하지만고분자 물질에 흡착된 glucose는 투석막을 통과하지 못할 것이라는 가정 하에 투석막을 이용하여 투석 내액의 glucose가 투석 외액으로 빠져 나오는 원리를 이용하여 실시하였다.3) 이 때투석막은 생체 내 장막의 투과 조건과 유사한 것으로 molecular weight cut-off가 비교적 낮은 투석막(Sigma D7884: M.W. C.O.>1, 200)을 사용하였다. 투석막 내부에 시료를 넣고 glucose 36 mg을 용해시킨 0.
- 5 cm)에 넣어 14 시간 동안 시료를 수화시켰다. 대조구의 경우에는 bile acid 용액만 넣고 시료는 제외시켰고, 시판용 polymer는 citrus pectin (Sigma, P9135), carboxymethyl-cellulose(Sigma, C4888)을 사용하였다. 이 용기에 0.
- 5 cm)에 넣어 14 시간 동안 시료를 수화시켰다. 대조구의 경우에는 fucose 용액만 넣고 polymer 시료는 제외시켰고, 시판용 polymer는 citrus pectin(Sigma, P9135), carboxymethyl-cellulose (Sigma, C4888)을 사용하였다. 이 용기에 0.
- 상징액에 동량부피의 ethanol을 첨가하여 교반봉으로 교반하는 조작을 수 회 반복하였다. 이후 DEAE-cellulose, Sephadex G-100 및 Sepharose CL-2B를 통과 시킨 후 최종 기능성 실험에 사용하였다. 이 때분획물은 증류수로 투석하여 동결 건조하였다.
- 균주 및 biopolymer의 분리는 전보1)에서의 방법을 사용하였다. 즉, 균주는 Bacillus coagulans CE-74를 실험에 사용하였으며 nutrient broth에서 예비 배양한 후 증자한 대두에 1% 되도록 접종하여 72 시간 배양하였다. Biopolymer의 분리는 전보에서의 방법에 준하여 배양물에 증류수를 가하여 진탕 추출하고 9,000xg로 원심분리하여 균체 및 불용성물질을 제거하였다.
이론/모형
- ACE 저해. ACE저해 효과 측정은 Cushman과 Ondetti(5)의방법에 의하여 행하였다. 즉, 반응구는 0.
- 일정한 시간 간격으로 투석 외액 1 m/씩을 취하여 taurocholic acid 함량을 분석하였다. Bile acid 흡수 억제 지수는 아래와 같이 계산하였으며 Bile acid 함량 분석은 Boyd 등4)의 방법에 따라 bile acid 용액 1 m/에 70% H2SQ4 용액 5ml를 더하고 5분 후에 0.25% furfural 용액 1 ml를 각각 첨가하여 60분간 방치하여 분홍색이 최대로 발색된 후 최대 흡수 파장인 510nm에서 흡광도를 측하였다.
- Tyrosinase 저해. Tyrosinase 활성저해 측정 방법은 tyrosinase의 작용 결과 생성되는 dopachrome을 비색법에 의해 측정하는 Yagi 등6)의 방법에 따라 실시하였다. Mushroom tyrosinase(Sigma, EC 1.
성능/효과
- 7) 본 연구에서 biopolymer의 fucose 흡수 지연 효과에 대한 실험 결과 우수한 흡수 지연 효과를 보여주었다. 이러한 glucose 흡수 지연 효과는 수용성 polymer의 경우 점성이높아 gel matrix를 형성하여 glucose를 붙잡는 효과로 장내의 glucose 확산을 떨어뜨리는 것으로 설명되고 있는데7)biopolymer 역시 높은 점성으로 인하여 우수한 glucose 흡수 지연 효과를 나타내는 것으로 생각된다.
- 1, 2와 같다. Bile acid 흡수 지연 효과가 우수하다고 보고7)된 바 있는 citrus pectin, CM-cellulose와 흡수 지연 효과를 비교한 결과, 투석 1 시간에서는 citrus pectin이 45%로 가장 높은 억제 지수를 보였으며 biopolymer 30%, CM-cellulose 18%순이었다. 투석 5 시간 후에도 citrus pectin 30%, biopolymer 20%, CM-cellulose 6%의 억제 지수를 보여 citrus pectin과 biopolymer는시간의 경과에 따라 억제 효과가 지속적으로 나타났다.
- Anderson과 Chen14)은 이런 작용으로 영양소의 소화, 흡수를 지연시켜 당뇨병 환자에게 glucose tolerance를 증진시키는 효과를 가지는 것으로 보고한바 있다. Biopolymer를 기존의 glucose 및 bile acid 흡수 지연효과가 뛰어나다고 보고된 pectin, CM-cellulose와 비교했을 때 pectin과 비슷한 효과를 보였으며, CM-cellulose보다는 우수한효과를 나타내었다. 이러한 효과를 지닌 biopolymer를 식품에응용할 경우 발효 기술의 개발로 대량 생산할 수 있는 이점이있다.
- Glucose 흡수과정을 24 시간까지 연장시켜 본 결과에서는 투석막을 통한 glucose 투과는 5 시간 경과시 약 75% 수준으로 이루어졌다. Biopolymer의 glucose 흡수 지연 효과는 시간이 경과함에 따라 감소하여 24 시간까지 연장하였을 경우에 biopolymer, citrus pectin 및 CM-cellulose를 첨가한 경우 모두에서 glucose가 거의 전부 투과되는 것으로 나타났다. 그러므로 본 biopolymer의 첨가는 식품을 통한 glucose 섭취시 초기에 glucose 흡수를 지연시키므로 혈액 내 glucose 농도를 완만하게 상승시키고, 음식물 섭취시간이 길어짐에 따라 polymer에의한 흡수지연 효과는 떨어져 전체적인 glucose 흡수량에는 큰차이를 가져오지는 않을 것으로 예상된다.
- 투석 2 시간 후에도 citrus pectin 32%, biopolymer 26%로 억제 효과가 지속적으로 나타났고 CM-cellulose와 비교했을 때 biopolymer의 지연 효과가 우수했다. Glucose 흡수과정을 24 시간까지 연장시켜 본 결과에서는 투석막을 통한 glucose 투과는 5 시간 경과시 약 75% 수준으로 이루어졌다. Biopolymer의 glucose 흡수 지연 효과는 시간이 경과함에 따라 감소하여 24 시간까지 연장하였을 경우에 biopolymer, citrus pectin 및 CM-cellulose를 첨가한 경우 모두에서 glucose가 거의 전부 투과되는 것으로 나타났다.
- Biopolymer의 glucose 흡수 지연 효과는 시간이 경과함에 따라 감소하여 24 시간까지 연장하였을 경우에 biopolymer, citrus pectin 및 CM-cellulose를 첨가한 경우 모두에서 glucose가 거의 전부 투과되는 것으로 나타났다. 그러므로 본 biopolymer의 첨가는 식품을 통한 glucose 섭취시 초기에 glucose 흡수를 지연시키므로 혈액 내 glucose 농도를 완만하게 상승시키고, 음식물 섭취시간이 길어짐에 따라 polymer에의한 흡수지연 효과는 떨어져 전체적인 glucose 흡수량에는 큰차이를 가져오지는 않을 것으로 예상된다.
- 투석 시간을 24 시간까지 연장한 결과 시간이 경과함에 따라 서서히 bile acid 투과가 일어나서 24 시간에서는 억제지수가 전 실험군에서 2~3% 수준으로 나타났다. 보릿가루에서 분리 정제한 β-glucan8)의 경우에서도 투석초기에 bile acid 흡수 지연 효과가크게 나타났으나 시간이 경과할수록 그 효과가 감소하였으며 30 분 경과시 β-glucan 농도가 1, 3% 첨가된 경우 bile acid retardation index(%)가 각각 3, 12%의 수준이었다. 게껍질에서추출한 chitin 및 이를 탈아세틸화한 chitosan9)은 투석 1 시간후 chitine 억제 지수가 20-30%, chitosane 15~34%이었으며, pectin이 가장 높은 효과를 보였다고 보고되어 본 실험의결과와 유사한 양상을 나타내었다.
- Tyrosinase 저해. 분리된 biopolymer# 5 μg/μl~20 μg/μl 농도로 조제하여 tyrosinase 저해효과를 관찰한 결과(Fig. 6) 12.2~48.5%의 저해를 보여 비교적 저해효과가 우수하였다. Tyrosinase 활성저해에 대해서는 많은 연구 결과가 있는데 Yagi 등6)은 알로에로부터 아세톤으로 추출 sHicagel fraction으로 분획한 2-O-feruloyl-aloesin과 aloesin이 0.
- ACE 저해. 분리된 biopolymer를 이용하여 고혈압 유발에관계하는 ACE에 대한 저해 효과를 관찰하였으며 3 μg/μl에서 53%의 저해를 시작으로 10μg/μl의 농도에서는 97%의 저해를보였다(Fig. 5). 각종 천연물로부터의 ACE 저해제 연구로는 단백질 가수분해 peptide, polyphenol류들이 주종을 이루고 있다.
- 그러므로 식품 산업에 이용한다면 물성 개량제의 용도뿐만 아니라, 단맛을 내기 위해 주로 사용하는 원료인 설탕, 포도당 등의 체내에서의 흡수를 지연시켜 혈액내 포도당의 완만한 상승에 도움을 줄 수 있는 기능성 원료로서의 응용도 기대된다. 이상에서 biopolymer는 비교적 우수한 glucose 및 bile acid 흡수지연 효과를 나타내었다. 그러나 비록 투석막을 이용한 in vitro 법에 의한 glucose 및 bile acid 흡수 지연 효과와 인체 실험결과가 같은 경향으로 보고7,14)되고 있으나 이러한 결과는 in vitro 상에서의 결과로 소화관내에서의 분해, 장내 효소에 의한분해 등을 고려할 때 이를 증명하기 위한 연구도 필요할 것이다.
- 투석 5 시간 후에도 citrus pectin 30%, biopolymer 20%, CM-cellulose 6%의 억제 지수를 보여 citrus pectin과 biopolymer는시간의 경과에 따라 억제 효과가 지속적으로 나타났다. 전반적으로 biopolymer의 흡수 지연 효과는 citrus pectin보다 낮았으나 동일농도의 CM~celkdose보다는 흡수 지연 효과가 높았으며, biopolymer의 함량을 CM-cellulose보다 1% 적게 첨가한 경우에도 CM-cellulose와 비슷한 지연 효과를 보였다. 투석 시간을 24 시간까지 연장한 결과 시간이 경과함에 따라 서서히 bile acid 투과가 일어나서 24 시간에서는 억제지수가 전 실험군에서 2~3% 수준으로 나타났다.
- 이때 biopolymer 첨가량을 1%로 한 경우에서도 citrus pectin 2% 첨가 수준의 효과를 보여 glucose 흡수 지연효과가 우수하였다. 투석 2 시간 후에도 citrus pectin 32%, biopolymer 26%로 억제 효과가 지속적으로 나타났고 CM-cellulose와 비교했을 때 biopolymer의 지연 효과가 우수했다. Glucose 흡수과정을 24 시간까지 연장시켜 본 결과에서는 투석막을 통한 glucose 투과는 5 시간 경과시 약 75% 수준으로 이루어졌다.
- Glucose 투과율은 초기에는 급속히 이루어지나 투석시간이 경과할수록 투과율은 떨어졌으며 흡수 지연 효과가 우수하다고 보고7)된 바 있는 citrus pectin, CM-cellulose와 흡수지연 효과를 비교하여 glucose의 흡수 지연 효과를 판단하였다. 투석 30 분 경과 후 citrus pectin 46%, biopolymer 44%, CM-cellulose는 6%의 fucose 흡수 지연 효과를 보여 biopolymer는 citrus pectin와 거의 같은 수준의 효과를 보였다 (Fig 4). 이때 biopolymer 첨가량을 1%로 한 경우에서도 citrus pectin 2% 첨가 수준의 효과를 보여 glucose 흡수 지연효과가 우수하였다.
- Bile acid 흡수 지연 효과가 우수하다고 보고7)된 바 있는 citrus pectin, CM-cellulose와 흡수 지연 효과를 비교한 결과, 투석 1 시간에서는 citrus pectin이 45%로 가장 높은 억제 지수를 보였으며 biopolymer 30%, CM-cellulose 18%순이었다. 투석 5 시간 후에도 citrus pectin 30%, biopolymer 20%, CM-cellulose 6%의 억제 지수를 보여 citrus pectin과 biopolymer는시간의 경과에 따라 억제 효과가 지속적으로 나타났다. 전반적으로 biopolymer의 흡수 지연 효과는 citrus pectin보다 낮았으나 동일농도의 CM~celkdose보다는 흡수 지연 효과가 높았으며, biopolymer의 함량을 CM-cellulose보다 1% 적게 첨가한 경우에도 CM-cellulose와 비슷한 지연 효과를 보였다.
- 전반적으로 biopolymer의 흡수 지연 효과는 citrus pectin보다 낮았으나 동일농도의 CM~celkdose보다는 흡수 지연 효과가 높았으며, biopolymer의 함량을 CM-cellulose보다 1% 적게 첨가한 경우에도 CM-cellulose와 비슷한 지연 효과를 보였다. 투석 시간을 24 시간까지 연장한 결과 시간이 경과함에 따라 서서히 bile acid 투과가 일어나서 24 시간에서는 억제지수가 전 실험군에서 2~3% 수준으로 나타났다. 보릿가루에서 분리 정제한 β-glucan8)의 경우에서도 투석초기에 bile acid 흡수 지연 효과가크게 나타났으나 시간이 경과할수록 그 효과가 감소하였으며 30 분 경과시 β-glucan 농도가 1, 3% 첨가된 경우 bile acid retardation index(%)가 각각 3, 12%의 수준이었다.
후속연구
- 전보에서저자 등은 polyglutamate 와 poly lysine과 같은 polypeptide 계의 biopolymer# 생산하는 미생물을 분리하고 생산된 고분자의 이화학적 특성1)과 물성학적 특성즈을 보고한 바 있다. Biopolymer 가 독특한 물성으로 식품을 비롯한 각종 분야에서 물성조절제등으로 사용되는 것을 상기할 때 생리활성을 아울러 가진다면산업적으로 큰 의미가 있는 것으로 아주 유용하게 이용할 수있을 것이다. 그러나 cellulose, pectin, 마 점질물 등의 고분자는 장내 흡수 지연 효과와 효소저해능 등의 기능성을 가짐이알려져 있으나 polypeptide에 대한 연구는 미진한 실정이다.
- 이상에서 biopolymer는 비교적 우수한 glucose 및 bile acid 흡수지연 효과를 나타내었다. 그러나 비록 투석막을 이용한 in vitro 법에 의한 glucose 및 bile acid 흡수 지연 효과와 인체 실험결과가 같은 경향으로 보고7,14)되고 있으나 이러한 결과는 in vitro 상에서의 결과로 소화관내에서의 분해, 장내 효소에 의한분해 등을 고려할 때 이를 증명하기 위한 연구도 필요할 것이다.
- 그리고 식품의 물성 개량제로 사용할 수 있으며 동시에체내 glucose의 완만한 흡수에도 도움을 줄 수 있을 것이다. 그러므로 식품 산업에 이용한다면 물성 개량제의 용도뿐만 아니라, 단맛을 내기 위해 주로 사용하는 원료인 설탕, 포도당 등의 체내에서의 흡수를 지연시켜 혈액내 포도당의 완만한 상승에 도움을 줄 수 있는 기능성 원료로서의 응용도 기대된다. 이상에서 biopolymer는 비교적 우수한 glucose 및 bile acid 흡수지연 효과를 나타내었다.
- 이러한 효과를 지닌 biopolymer를 식품에응용할 경우 발효 기술의 개발로 대량 생산할 수 있는 이점이있다. 그리고 식품의 물성 개량제로 사용할 수 있으며 동시에체내 glucose의 완만한 흡수에도 도움을 줄 수 있을 것이다. 그러므로 식품 산업에 이용한다면 물성 개량제의 용도뿐만 아니라, 단맛을 내기 위해 주로 사용하는 원료인 설탕, 포도당 등의 체내에서의 흡수를 지연시켜 혈액내 포도당의 완만한 상승에 도움을 줄 수 있는 기능성 원료로서의 응용도 기대된다.
- 또한 현대인의 피부미용에 대한 관심이 높아짐에 따라기미, 주근깨 등의 피부의 색소 침착에 관여하는 것으로 알려진 tyrosinase의 활성을 감소시켜 피부의 색소 침착을 억제하고자 하는 연구가 부각되고 있다. 본 연구에서 분리한 biopolymer 는 이러한 tyrosinase 저해능을 가지는 것으로 밝혀졌으며 이는물성개량제로서의 역할과 생리적 기능성 두 가지 점을 충족시켜 줄 수 있는 것으로 새로운 피부질환 치료제, 식품 갈변 방지제로 응용이 가능하리라 사료되며, 화장품에도 응용할 수 있는 물성을 가지고 있는 점을 상기할 때 보습제, 점증제 등으로화장품에 이용할 경우 미백효과도 지니면서 보습효과나 점증효과를 지닌 기능성 원료로도 사용할 수 있으리라 사료된다.
- 또한 Suh 등19)이 식품에 존재하는 ACE 저해물질은 기존 상품화된 혈압강화제와 비교했을 때 비교적 낮은 활성을 나타낸다하더라도 대량으로 섭취하는 식품에존재한다는 점에서 그 유용성을 제안한 바 있다. 이상에서 biopolymer는 ACE 저해제의 가능성을 보였으므로 추후 체내에서의 분해, 흡수된 후의 형태 등을 고려한 연구가 증명이 된다면 식품산업에서 다용도로 사용할 수 있을 것이다.
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