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문제 정의
- 따라서 본 연구의 목적은 난용성 인산염을 가용화 시킬 수 있는 경제적이고, 고효율적인 생물비료의 개발함을 위한 기초연구로 난용성 인산염의 가용화 우수 미생물을 분리하여 동정하였으며, 선발된 미생물의 배양학적 특성에 따른 난용성 인산가용화를 조사하였다.
- 가진 것으로 잘 알려져 있다. 따라서 분리균주에서도 plasmid DNA의 존재 여부 및 존재할 경우 인산가용화에 관여하는 기능이 있는지 밝혀보고자 A hydrophila DA57로부터 미지의 plasmid DNA를 분리하였다(Fig. 6). BamH I으로 처리한 결과, 단일 band로서 약 4.
- 인산가용화균 DA57 균주의 배양학적 특성에 따른 난용성 인산염 가용화능의 차이를 조사하였다;. 배양온도 차이에 따른 영향은 26P, 30℃, 37℃에서 실시하였고, 배지의 초기 배양 pH별에 따른 영향은 pH 5.
제안 방법
- 300 m/ 삼각 flask에 각종 난용성 인산염이 0.5% 첨가된 SM배지 100mZ에 전배양한 균주를 접종한후, 160rpm으로 필요한 시간동안 연속적으로 진탕배양하면서 배양액을 원심분리하여 얻어낸 상등액 내의 유리인산 농도와 pH 변화를 일정시간마다 측정하였다. 즉, 균체배양액 1ml을 eppendorf tube에 담은 후 소형원심분리기로 13,000 rpm, 5분간 실온에서 원심분리하였다.
- A. hydrophila DA 57의 배양학적 특성에 따른 인산가용화 특성을 조사하기 위해 배양 온도별, 배양 초기 pH 별, 배지 조성의 차이에 따라 실험하였다. Fig.
- A. hydrophila DA57 의 tri-calcium phosphate, hydroxyapatite, aluminium phosphate 등의 다양한 난용성 인산염 기질에 대한 인산 가용화능을 포장온도에 근접한 26P 처리구에서 비교조사하여 Fig. 4에 나타냈다. 그 결과, tri-calcium phospahte를 기질로 사용했을 때, 배양 72시간에 4.
- 위해 그람염색을 실시한. 결과를 이용하여 API system 32GN strip과 API 20E strip을 이용하여 동정하였다.
- 0에서 glucose를 1%, 3%, 5% 농도별로 첨가하여 실시하였다. 균주에 의한 pH변화와 유리 인산 생성능은 12시간마다 측정하였으며 , 이상의 배양 환경에 관한 모든 실험은 2회 반복 수행하여 평균값을 구함으로써 실험오차를 최소화하였다.
- Pseudomonas sp.로부터 정제된 gluconate dehydrogenase (GDH)를 사용하여 측정하였다. L broth에 인산가용화균 DA57 균주를 전 배양 후 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.
- 5에 나타나 있다. 배양액 속의 gluconic acid 는 반응액 속의 glucose dehydrogenase를 이용하여 DCIP가 감소되는 양으로서 측정하였다. 분리균주는 glucose 최소 배지에서 배양 2일째 4mM의 gluconic acid를 생성하였으며, 3일째 경과시에는 약간 감소하는 경향을 보였다.
- 조사하였다;. 배양온도 차이에 따른 영향은 26P, 30℃, 37℃에서 실시하였고, 배지의 초기 배양 pH별에 따른 영향은 pH 5.0, 6.0, 7.0에서 실시하였다. 배지 조성의 차이에 따른 영향은 26℃, 초기배양 pH 5.
- 0에서 실시하였다. 배지 조성의 차이에 따른 영향은 26℃, 초기배양 pH 5.0에서 glucose를 1%, 3%, 5% 농도별로 첨가하여 실시하였다. 균주에 의한 pH변화와 유리 인산 생성능은 12시간마다 측정하였으며 , 이상의 배양 환경에 관한 모든 실험은 2회 반복 수행하여 평균값을 구함으로써 실험오차를 최소화하였다.
- 배양액을 eppendrof tube에 담은 후 소형원심분리기로 6, 000rpm, 5분간 실온에서 원심 분리 하였다. 상층액을 반응액 (0.1 M potassium phosphate buffer, pH 6.0, 10 mM dichloroindophenol, 3mM phenazine methosulfate, glucose dehydrogenase 0.1 unit, H2O /1 ml)19-20)에 혼합하여 25℃ 600 nm에서 dichloroindophenol의 감소 정도로 배양액 속의 gluconic acid 함량을 측정하였다.
- 염류집적 및 인산과다처리 재배지로부터 채취하여 조제한 토양 10 g을 100 mZ의 멸균수에 넣고 200rpm으로 30분 동안 혼합한 후, 희석평판법으로 6단계까지 희석한 시료를 L broth에 도말하였다. 생성된 콜로니를 0.
- 인산가용화균 DA57 균주의 난용성 인산염 종류별에 따른 난용성인산염 가용화능의 차이를 조사하였다. 즉, 3종류의 난용성 인산염, tri-calcium phosphate, hydroxyapatite 및 aluminuim phosphate가 0.
- 가용화능의 차이를 조사하였다. 즉, 3종류의 난용성 인산염, tri-calcium phosphate, hydroxyapatite 및 aluminuim phosphate가 0.5% 함유된 SM배지, pH 6.0에서 12시간마다 분리 균주의 인산가용화능 및 pH변화를 측정하였다.
대상 데이터
- 1차 선별된 균주는 인산염 첨가 배지에서 유리 인산 생성량이 비교적 높은 수준의 세균을 선발하였으며, DA23, DA33, DA57, DA기로 명명된 4종이 높은 인산가용화능을 나타내었다. 그 중에서 인산가용화능이 가장 우수한 DA57 균주를 계속하여 실험하였다.
- 시료를 L broth에 도말하였다. 생성된 콜로니를 0.5% tri-calcium phosphate가 함유된 sucrose minimal(SM) 고체배지 (sucrose 10g, NH4NO3 0.27 g, KCI 0.2g, MgSO4 . 7H2O 0.1 g, MnSO4 . 6H2O 1 mg, FeSO4 - 7H2O 1 mg, Yeast extract 0.1 g, 난용성 인산염 5 g, agar 1.2%, H2O/1L)6에 접종하여 27℃ 3일간 배양하여 투명대 (clear zone)를 형성하는 균주를 선발하였다.
- 원심분리 후 상등액 10 μl을 취하고 여기에 멸균수 90μl을 첨가하여 총 100μl가 되게 하고, 여기에 phosphorus reagent 900μl를 첨가하여 혼합한후 15분간 실온에서 방치한 다음, 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 실험에 사용한 용액은 Sigma사에서 제조한 phosphrous reagent kit를 사용하였다.
- 인산가용화균 DA57의 plasmid DNA는 Promega Biotech사의 Wizard kit를 사용하여 분리하였으며, DNA 절단 실험을 위한 제한효소는 Takara Shuzo Co4 의 제한효소를 사용하였다.
이론/모형
- 난용성 인산염 가용화능이 확인된 인산가용화균을 동정하기 위하여 생화학적, 생리적 특성을 Bergey's manual에 따라 조사하여 동정하였으며, 아울러 정확성을 높이기 위해 그람염색을 실시한. 결과를 이용하여 API system 32GN strip과 API 20E strip을 이용하여 동정하였다.
성능/효과
- 3일 후에 투명대를 관찰한 결과, 약 5000개의 분리 균종 중 10% 이상의 균주가 분명한 투명대를 보였으며 그 중에서 비교적 투명대 영역이 넓게 나타난 균주 수십종을 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주는 인산염 첨가 배지에서 유리 인산 생성량이 비교적 높은 수준의 세균을 선발하였으며, DA23, DA33, DA57, DA기로 명명된 4종이 높은 인산가용화능을 나타내었다. 그 중에서 인산가용화능이 가장 우수한 DA57 균주를 계속하여 실험하였다.
- 콜로니의 모양, 색깔 등으로 보아 다른 균주로 생각되는 것을 tri-calcium phosphate가 함유된 SM 고체배지 상에 접종하여 배양하였다. 3일 후에 투명대를 관찰한 결과, 약 5000개의 분리 균종 중 10% 이상의 균주가 분명한 투명대를 보였으며 그 중에서 비교적 투명대 영역이 넓게 나타난 균주 수십종을 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주는 인산염 첨가 배지에서 유리 인산 생성량이 비교적 높은 수준의 세균을 선발하였으며, DA23, DA33, DA57, DA기로 명명된 4종이 높은 인산가용화능을 나타내었다.
- 6). BamH I으로 처리한 결과, 단일 band로서 약 4.5 kb의 크기를 나타내었으 며 , Kpn I으로 처리한 결과 약 1 kb와 3.5 kb 크기를 보여 이 plasmid DNA의 크기는 4.5 kb임을 알 수 있었다. 그러나 인산가용화능과의 관계 및 기능은 미해명된 상태이다.
- 4에 나타냈다. 그 결과, tri-calcium phospahte를 기질로 사용했을 때, 배양 72시간에 4.62의 pH 저하로 최대 154.2ppm의 유리인산을 방출하였으며, hydroxy apatite를 기질로 사용했을때, 4.기로의 pH 저하와 최대 비교적 높은 유리인산을 방출하였다. 반면에 aluminium phosphate의 경우, 3.
- 62 까지의 저하와 더 높은 인산가용화능이 나타났다. 그러나, 같은 조건과 같은 시간대의 인산가용화능을 비교하면, A. hydmphila DA57의 인산가용화능은 30℃일 때 우수하였다. 배지 조성의 차이에 따른 인산가용화능의 효과는 glucose가 3% 함유된 최소배지에서 더욱더 높은 효과를 나타내어 유리인산의 방출량이 108시간에 930ppm으로 나타났다(Fig.
- 의 가능성이 높았다. 동정의 정확성을 기하기 위해 균주를 API 20E 및 32GN strip을 사용하여 동정 실험한 결과, DA57은 Aeromonas hydrophila와 일치하였다(Table 1). 분리 동정된 A.
- 이러한 경향은 이균주를 미생물 비료로서 개발하기 위하여, 포장 온도인 저온하에서 좀더 유효한 인산가용화능을 가져야 한다는 조건에 잘 부합되어진다. 모든 처리구의 경우 배양 1일 후부터는 배양액의 pH가 급격히 감소하였으며, 26℃의 경우 72시간에는 pH 4.62 까지의 저하와 더 높은 인산가용화능이 나타났다. 그러나, 같은 조건과 같은 시간대의 인산가용화능을 비교하면, A.
- hydmphila DA57의 인산가용화능은 30℃일 때 우수하였다. 배지 조성의 차이에 따른 인산가용화능의 효과는 glucose가 3% 함유된 최소배지에서 더욱더 높은 효과를 나타내어 유리인산의 방출량이 108시간에 930ppm으로 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과는 배양시간 60시간에 Kim 등이21) 난용성 인산염 우수균으로 분리한 Rhanella aquatilis가 hydroxy apatite를 가용화하는 능력보다 2배 정도 우수한 것으로 나타났다.
- 배양액 속의 gluconic acid 는 반응액 속의 glucose dehydrogenase를 이용하여 DCIP가 감소되는 양으로서 측정하였다. 분리균주는 glucose 최소 배지에서 배양 2일째 4mM의 gluconic acid를 생성하였으며, 3일째 경과시에는 약간 감소하는 경향을 보였다. 한편, 대조군으로서 사용한 E.
- 모든 처리구에서 배양 72시간 이후는 pH 저하와 최대 유리인산의 방출량은 영향이 없었다. 이 결과에 따라 A. hydmphila DA57은 배양시 초기 pH에는 큰 영향을 받지 않으며, 특히초기 배양 pH가 5.0일 때 인산가용화능이 우수하였다.
- 부단히 이루어져 왔다. 이미 1950년대에 러시아와 동유럽에서 불용성 인산을 가용화시킬수 있는 미생물 (phosphobacteria)을 분리하여 토양에 처리한 결과 작물의 인산흡수를 증대시킬 수 있었으며, 평균 10%의 수량증가를 보았다.6)1980년대에는 P.
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