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문제 정의
- 본 연구에서는 RAPD 분석법을 이용하여 임업연구원에서 보존하고 있는 야생표고균주의 유전적인 특성과 각 지역간의 유전적인 변이에 관해 얻어진 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- DNA증폭을 위한 random primer는 Operon사의 10-base oligonucleotide primer kit를 사용하였다(Table 2). PCR 증폭은 10ng/㎕의 genomic DNA template와 1.
- Dendrogrant은 위의 유사도 값을 근거로 UPGMA(Unweighted pair-group method with arithmetic means) 분석을 통해 각 균주들간의 유연관계를 밝혔다. 표고 천연집단의 유전변이 정도 및 유전적 이질성을 파악하기 위하여 집단별 분산을 구하였으며, Bartlett test를 실시하였다(Excoffier, 1995; Stewart와 Excoffier, 1996).
- Genomic DNA의 추출을 위하여 보관 중인 균주들을 PDA배지에서 일주일간 계대 배양하였다. 다시 새로운 PDA배지에 nylon membrane(Amersham)을 얹은 후, 코르크버러를 이용하여 배양하고 있던 균사를 5 mm 정도 잘라내어 nylon membrane을 얹은 PDA 배지에서 계대배양하였다.
- Gnomic DNA의 추출은 M6115(1992)의 방법을 일부 변형하여 추출하였다. 균사가 들어있는 1.
- PCR 산물은 TBE buffer에서 1% agarose gel을 이용하여 3시간 전기영동한 후 0.5μg/ml의 ethidium bromide로 염색하여, U.V. transilhimiuator에서 결과를 확인한 후 Polaroid film을 이용하여 촬영하였다. PCR에 의한 중폭산물은 100 bp DNA ladder marker(Pharmacia Biotech)를 사용하여 증폭된 산물의 크기를 '추정하였다.
- PCR 증폭 조건은 94℃에서 1분간 denaturation과 36℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 2분간 extension으로 45 cycle까지 반복실행하였으며, 처음 denaturatig시간은 94℃에서 5분간 그리고 마지막 extension시간은 72℃에서 5분간 연장시킨 후 반응이 끝나면 4℃에서 유지되도록 하였다.
- transilhimiuator에서 결과를 확인한 후 Polaroid film을 이용하여 촬영하였다. PCR에 의한 중폭산물은 100 bp DNA ladder marker(Pharmacia Biotech)를 사용하여 증폭된 산물의 크기를 '추정하였다.
- RAPD 검정법을 이용하여, 우리나라에 자생하고 있는 야생 표고균주의 지역 간 유전변이에 관해 분석하였다. 사용된 야생표고균주는 계방산 수집 10개, 오대산 수집 11개, 지리산 수집 H개의 야생표고 총 32균주를 사용하였다.
- 그리고 재현성 검증을 위해 일부의 primer에서 2회 반복실험을 하였다.
- 다시 새로운 PDA배지에 nylon membrane(Amersham)을 얹은 후, 코르크버러를 이용하여 배양하고 있던 균사를 5 mm 정도 잘라내어 nylon membrane을 얹은 PDA 배지에서 계대배양하였다. 약 한 달간 배양한 후 nylon membrane위에서 자란 균사들을 긁어 genomic DNA 추출에 사용하였다.
- 우리나라 3개 지역의 산, 계방산, 오대산, 지리산에서 채집한 야생표고 각각 10개, 11개, 11개 균주들에 대해 RAPD분석에 의해 얻어진 결과로 각 균주간 유전 변이에 관해 비교 분석하였다 (Fig. 1, Table 1).
대상 데이터
- 1. Logations of Mt. Odae, Mt. Kyebang and Mt. Jiri in South Korea, where 32 wild strains of Lentinula edodes were collected.
- 본 실험에 사용된 균주들은 계방산, 오대산, 지리산에서 채집된 야생표고균주들중 임업 연구원 버섯연구실에서 보존 중인 계방산 10, 오대산11, 지리산11균주를 사용하였다 (Fig. 1, Table 1).
- 사용된 야생표고균주는 계방산 수집 10개, 오대산 수집 11개, 지리산 수집 H개의 야생표고 총 32균주를 사용하였다. Genomic DNA를 추출하여 10개의 random primer를 사용하여 PCR 증폭시킨 후 전기영동한 결과 170개의 밴드가 관찰되었으며, 그중 다 형성 밴드는 161개가 검출되었다 이들 전기영동상에 나타난 밴드의 유무(1,0)로 cluster 분석을 한 결과, 계방산과 오대산 표고균주들이 하나의 그룹으로, 나머지 지리산 표고균주들이 다른 하나의 그룹으로 형성되었다.
- 5 kb 사이에서 나타났다. 총 증폭산물은 170개였으며, 그 중 다형성 증폭산물은 161개로 각 균주 간 다양한 증폭산물의 분획양상이 관찰되었다 (Fig. 2). 사용된 primer에서 표고의 공통 유전인자로 보이는 증폭산물이 0.
데이터처리
- 유연관계를 밝혔다. 표고 천연집단의 유전변이 정도 및 유전적 이질성을 파악하기 위하여 집단별 분산을 구하였으며, Bartlett test를 실시하였다(Excoffier, 1995; Stewart와 Excoffier, 1996).
이론/모형
- PCR을 이용하여 증폭된 유전자의 RAPD 분석을 위해서 전기영동상의 밴드 유무에 대하여 Rohlf(1993)의 NTSYS-pc(version 1.80)를 이용하여 수행하였으며, 계산식은 다음과 같다.
성능/효과
- 10개의 random primer를 이용하여 각균주들을 PCR 증폭시킨 후 전기영동한 결과, 증폭된 산물은 0.4-2.5 kb 사이에서 나타났다. 총 증폭산물은 170개였으며, 그 중 다형성 증폭산물은 161개로 각 균주 간 다양한 증폭산물의 분획양상이 관찰되었다 (Fig.
- 사용된 야생표고균주는 계방산 수집 10개, 오대산 수집 11개, 지리산 수집 H개의 야생표고 총 32균주를 사용하였다. Genomic DNA를 추출하여 10개의 random primer를 사용하여 PCR 증폭시킨 후 전기영동한 결과 170개의 밴드가 관찰되었으며, 그중 다 형성 밴드는 161개가 검출되었다 이들 전기영동상에 나타난 밴드의 유무(1,0)로 cluster 분석을 한 결과, 계방산과 오대산 표고균주들이 하나의 그룹으로, 나머지 지리산 표고균주들이 다른 하나의 그룹으로 형성되었다. 또한 AMOVA 분석 결과 세 지역의 집단간 유전적인 차이는 12.
- 각 균주들 간에 표고의 공통 유전인자로 생각되는 증폭산물 외에 다 형성 증폭산물 의 존재가 확인되었고, 특히 공시 32개 균주들을 수집한 각각의 지역에서 유전인자의 차이가 관찰되어짐으로써 우리나라 야생 표고균주들의 변이가 확인되었다. Sunagawa 등(1995)은 일본, 뉴기니아, 타이빼이 등지에서 수집한 11개의 표고균주를 RAPD법에 의해 분석한 결과 3개의 random primer에서 각 지역에 따른 균주간의 변이를 확인하였다고 보고하였고, Zzng과 Molina(1994)도 6개국에서 수집한 15개의 표고균주에서 역시 균주간에 뚜렷한 변이를 나타내었다고 하였다.
- 따라서계방산과 오대산에서 채집한 균주들의 UPGMA 분석 결과 뚜렷하게 별도의 그룹으로 구분되지 못하는 것은 계방산과 오대산은 그룹 내 분화가 큰 것이 주요 원인일 것으로 생각된다. 그러나 지리산 균주들은 지리산균주들끼리 하나의 그룹이 형성되어 계방산과 오대 산과의 유전적인 차이가 뚜렷이 나타나므로 계방산, 오대산과 지리산은 서로 유전적 격리가 존재함을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 또한 이 등(1997)은 표고의 우량품종 선발을 위한 표지인자 탐색을 위해 RAPD법을 이용하여 우리나라 등록 품종 간에 유전적인 차이를 밝혔다. 그러므로 이들 보고 내용들로 미루어 볼 때 표고균주의 지역 간 유전적인 차이가 인정되어지며 균주간 변이가 일어나고 있다는 것을 알 수 있다.
- 증폭산물이 가장 많이 관찰되었다. 그리고 오대산의 0-2와 0-3균주는 10개의 primer를 이용한 전기영동상의 결과, 모두에서 같은 중폭산물의 분획 양상을 나타내어 동일 균주일 것으로 추정된다.
- Genomic DNA를 추출하여 10개의 random primer를 사용하여 PCR 증폭시킨 후 전기영동한 결과 170개의 밴드가 관찰되었으며, 그중 다 형성 밴드는 161개가 검출되었다 이들 전기영동상에 나타난 밴드의 유무(1,0)로 cluster 분석을 한 결과, 계방산과 오대산 표고균주들이 하나의 그룹으로, 나머지 지리산 표고균주들이 다른 하나의 그룹으로 형성되었다. 또한 AMOVA 분석 결과 세 지역의 집단간 유전적인 차이는 12.5%를 나타내었고, 각 균주들 간에는 87.5%임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 계방산과 오대산 균주들은 그룹 내 분화가 큰 것이 주요 원인일 것으로 생각되며, 반면, 지리산균주들은 계방산과 오대산과는 유전적 격리가 존재함을 알 수 있었다.
- 898로 높은 유연관계를 나타내었으며, 지리산 균주들간에는 거의 비슷한 유사도를 나타내면서 하나의 그룹이 형성되었다. 또한 집단 간 유전적 분화 정도를 알아보기 위하여 AMOVA 분석을 한 결과 비교적 낮게 나타났으며, 전체 변이 중 12.5%의 집단 간 유전적 차이를 나타내었다(Table 3). 각 지역 간 유전적 거리는 계방산과 오대산이 0.
- 또한계방산, 오대산, 지리산에서 채집한 표고균주에 대하여 유연관계를 분석한 결과계방산에서 채집한 균주들 중 K-5와 K-6은 유사도 0.938로 아주 높은 유연관계를 나타내었고, K-7과 K-10도 0.859로 높은 유연관계를 나타내었다. 반면 K-2 균주는 K-7 균주와 0.
- 조 등(2000)에 의한 11개 지역에서 채집한 송이의 유전변이를 조사한 결과 4개의 그룹으로 나누어지며, 또한 이들은 산지간 및 산지 내 개체 간 변이를 관찰하였다고 보고하였다. 본 연구에서도 계방산, 오대산 및 지리산 지역의 야생 표고 균주들 간에 유전적인 변이가 뚜렷이 관찰되었으며, 또한 각 지역의 다양한 유전인자의 존재도 확인할 수 있었다. 그러므로 우리 나라야생 표고균주의 유전적인 특성과 각 지역의 유전 특성을 비교 분석하고, 외국 품종의 특성을 비교 분석하면, 현재 외국에서 들어오고 있는 표고균주들과 우리 고유의 표고 균주들을 구별할 수 있는 DNA marker를 찾을 수 있을 것으로 생각된다.
- 5%임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 계방산과 오대산 균주들은 그룹 내 분화가 큰 것이 주요 원인일 것으로 생각되며, 반면, 지리산균주들은 계방산과 오대산과는 유전적 격리가 존재함을 알 수 있었다.
- 전기영동 결과 각균주들 간에 가장 뚜렷한 차이를 나타낸 것은 계방산의 K-2 균주와 오대산의 0-6균주로 다형성 증폭산물이 가장 많이 관찰되었다. 그리고 오대산의 0-2와 0-3균주는 10개의 primer를 이용한 전기영동상의 결과, 모두에서 같은 중폭산물의 분획 양상을 나타내어 동일 균주일 것으로 추정된다.
후속연구
- 또한 이들 야생 표고 균주의 유전적 특성을 잘 이용하면 새로운 표고 품종 육성에도 이용할 수 있을 것이다. 그러므로 본 연구 결과는 앞으로 표고품종 육성에 있어 분자생물학적 방법을 이용한 기초 연구 자료가 될 것으로 기대된다.
- 본 연구에서도 계방산, 오대산 및 지리산 지역의 야생 표고 균주들 간에 유전적인 변이가 뚜렷이 관찰되었으며, 또한 각 지역의 다양한 유전인자의 존재도 확인할 수 있었다. 그러므로 우리 나라야생 표고균주의 유전적인 특성과 각 지역의 유전 특성을 비교 분석하고, 외국 품종의 특성을 비교 분석하면, 현재 외국에서 들어오고 있는 표고균주들과 우리 고유의 표고 균주들을 구별할 수 있는 DNA marker를 찾을 수 있을 것으로 생각된다. 또한 이들 야생 표고 균주의 유전적 특성을 잘 이용하면 새로운 표고 품종 육성에도 이용할 수 있을 것이다.
- 그러므로 우리 나라야생 표고균주의 유전적인 특성과 각 지역의 유전 특성을 비교 분석하고, 외국 품종의 특성을 비교 분석하면, 현재 외국에서 들어오고 있는 표고균주들과 우리 고유의 표고 균주들을 구별할 수 있는 DNA marker를 찾을 수 있을 것으로 생각된다. 또한 이들 야생 표고 균주의 유전적 특성을 잘 이용하면 새로운 표고 품종 육성에도 이용할 수 있을 것이다. 그러므로 본 연구 결과는 앞으로 표고품종 육성에 있어 분자생물학적 방법을 이용한 기초 연구 자료가 될 것으로 기대된다.
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