두툽상어(Scyliorhinus torazame)Metallothionein cDNA의 cloning 및 이의 분자적 특성 Molecular Cloning and Characterization of a Novel Metallothionein Isoform Expressed in Tiger Shark(Scyliorhinus torazame)원문보기
두툽상어의 간조직 cDNA library의 EST를 통해 중금속의 세포내 농도 조절과 환경으로부터 흡수한 유해 중금속의 해독작용 등의 기능을 수행하는 MT 유전자를 cloning하였다. 염기서열 분석 결과 두툽상어의 MT 유전자는 204bp의 coding 영역과 182bp의 3'UTR 영역으로 구성되어 있었으며, 종결코돈 이후 162bp의 polyadenylatin 신호서열과 이로부터 15bp 이후의 poly(A)서열 등이 확인되었다. 염기서열로부터 유추한 68개의 아미노산 서열에는 다른 척추동물에서와 같이 Cys 잔기가 전체의 29.4%(20/68)로 풍부하였으며, 아미노산 서열수준에서 포유류와는 43~54%, 어류들과는 41~45%의 상동성을 나타냈었다. 특히 20개의 Cys은 어류와 18개가 다른 척추동물과는 19개가 잘 보존되어 있었다. 두툽상어 MT는 특이하게 모든 척추동물에서 잘 보존된 $\beta$-domain 끝 쪽의 9번째 Cys앞에 5개의 아미노산을 더 갖고 있었으며, 경골어류 MT의 특징인 4번째 위치의 gap이 없고, 18번째 Cys의 위치가 어류와 달리 다른 척추동물들과 같았다. 또한 C 말단의 아미노산 잔기가 다른 생물체와는 모두 다른 Ser을 갖는 특징을 나타내었다. 이와 같은 두툽상어 MT유전자의 특징들은 연골어류의 분자적 진화과정을 알 수 있는 분자 표지유전자로 이용할 수 있을 것이다.
두툽상어의 간조직 cDNA library의 EST를 통해 중금속의 세포내 농도 조절과 환경으로부터 흡수한 유해 중금속의 해독작용 등의 기능을 수행하는 MT 유전자를 cloning하였다. 염기서열 분석 결과 두툽상어의 MT 유전자는 204bp의 coding 영역과 182bp의 3'UTR 영역으로 구성되어 있었으며, 종결코돈 이후 162bp의 polyadenylatin 신호서열과 이로부터 15bp 이후의 poly(A)서열 등이 확인되었다. 염기서열로부터 유추한 68개의 아미노산 서열에는 다른 척추동물에서와 같이 Cys 잔기가 전체의 29.4%(20/68)로 풍부하였으며, 아미노산 서열수준에서 포유류와는 43~54%, 어류들과는 41~45%의 상동성을 나타냈었다. 특히 20개의 Cys은 어류와 18개가 다른 척추동물과는 19개가 잘 보존되어 있었다. 두툽상어 MT는 특이하게 모든 척추동물에서 잘 보존된 $\beta$-domain 끝 쪽의 9번째 Cys앞에 5개의 아미노산을 더 갖고 있었으며, 경골어류 MT의 특징인 4번째 위치의 gap이 없고, 18번째 Cys의 위치가 어류와 달리 다른 척추동물들과 같았다. 또한 C 말단의 아미노산 잔기가 다른 생물체와는 모두 다른 Ser을 갖는 특징을 나타내었다. 이와 같은 두툽상어 MT유전자의 특징들은 연골어류의 분자적 진화과정을 알 수 있는 분자 표지유전자로 이용할 수 있을 것이다.
A complementary DNA encoding metallothionein(MT), a heavy metal-responsive protein was cloned from a cartilaginous shark species. Scyliorhinus torazame. An expressed sequence tag(EST)from the shark liver, which showed high similarity with a MT gene, was isolated and its full-length sequence(390bp)wa...
A complementary DNA encoding metallothionein(MT), a heavy metal-responsive protein was cloned from a cartilaginous shark species. Scyliorhinus torazame. An expressed sequence tag(EST)from the shark liver, which showed high similarity with a MT gene, was isolated and its full-length sequence(390bp)was determined. The putative shark MT cDNA sequence contained an open reading frame consisting 68 amino acids and 182bp of 3-untranslated region including the poly (A+) signal. The deduced amino acid sequence was 41-54% identical to those of other animals including mammals and fish species. Tiger shark MT cDNA showed high conservation in the Cys regions. however, peculiarly contained not only additional five amino acids just prior to the conserved beta-domain but also a Ser residue at C terminal, which has not been seen in other MT sequences.
A complementary DNA encoding metallothionein(MT), a heavy metal-responsive protein was cloned from a cartilaginous shark species. Scyliorhinus torazame. An expressed sequence tag(EST)from the shark liver, which showed high similarity with a MT gene, was isolated and its full-length sequence(390bp)was determined. The putative shark MT cDNA sequence contained an open reading frame consisting 68 amino acids and 182bp of 3-untranslated region including the poly (A+) signal. The deduced amino acid sequence was 41-54% identical to those of other animals including mammals and fish species. Tiger shark MT cDNA showed high conservation in the Cys regions. however, peculiarly contained not only additional five amino acids just prior to the conserved beta-domain but also a Ser residue at C terminal, which has not been seen in other MT sequences.
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제안 방법
A gage에 포함되어 있는 cDNA clone들을 plas-midvoctoi에 subdoning 하기 위해 helper phage를 이용하여 in vivo excision을 수행 하였다. Excised phage를 SOLR 세포에 감염시켜 cDNA를 포함하는 colony를 얻었으며, alkali lysis 방법으로 plasmidDNA를 추출하여 염기서열 분석에 이용하였다 염기서열 분석은 형광 표지된 ddNTP를 포함하는BigDye terminator (Peridn Elmer, USA)를 이용하여 PCR 반응 후 ABI Prism 377 DNA sequencer (PE,USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다
excision을 수행 하였다. Excised phage를 SOLR 세포에 감염시켜 cDNA를 포함하는 colony를 얻었으며, alkali lysis 방법으로 plasmidDNA를 추출하여 염기서열 분석에 이용하였다 염기서열 분석은 형광 표지된 ddNTP를 포함하는BigDye terminator (Peridn Elmer, USA)를 이용하여 PCR 반응 후 ABI Prism 377 DNA sequencer (PE,USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다
magnetic particle^. mRNA만을 순수분리하였다 cDNA library의 제조는 ZAP<DNA Synthesis Kit와 ZAP cDNA Gig^ack m Gold Cloning Kit (Strata-gene, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성한 후 cDNAlitay를 제조하였다
, 2001), 원시어류의 유전자탐색은 이를 이용한 기능성 단백질 및 분자 진화적유연관계 등의 연구에 매우 유용하게 이용될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 원시 연골어류인 두툽상어(Scylinus torazame)로부터 EST을 이용하여 MT 유전자를 cloning 한 후 이의 분자적 특성을 비교 분석하였다
데이터처리
EST 염기서 열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 GenBank를 blastx 검색을 통 해 MT 유전자와의 상동성을 확인하였다 또한 얻 어진 염기서열과 아미노산 서열은 MultAlin(Corpet, 1988)과 ClustalW (Thompson et aL, 1994) 등 서 열 다 중배열 프로그램을 이용하여 상동성을 비교 분석 하였다 "유전자의 아미노산 서열을 이용한 계 통도 작성은 PRODIST 통해 얻어진 distance matrix를 NEIGHBOR의 Neighbor-Joining 방법으로 분석하여 drowns 프로그램으로 작성하였다.
성능/효과
두툽상어의 간조직 cDNA libray의 EST를 통해 MT 유전자를 cloning하였다 염기서열 분석 결과두툽상어 의 MT 유전자는 204 bp의 coding 영 역 과 182bp의 3 ' UTR 영역으로 구성되어 있었으며, 종결코돈 이후 162 bp의 polyadenylation 신호서열과 이로부터 15 bp 이후의 poly (A) 서열 등이 확인되었다 (Fig. 1).
알려진 다른 종들과의 아미노산 서열 다중분석결과 포유류와는 43 - 54%, 어류들과는 41~45%의서열 상동성을 보였으며 특히 20개의 Cys은 어류와 18개가, 다른 척추동물과는 19개가 잘 보존되어 있었다. 두툽상어 "는 특이하게 모든 척추동물에 서 잘 보존된 ^-domain 끝 쪽의 9번째 Cys 앞에 5개 의 아미노산을 더 갖고 있었으며, 경골어류 MT의 특징(BinzandKagi, 1999)인 4번째 위치의 gap이 없 고, 18번째 Cys의 위치가 어류와 달리 다른 척추동물들과 같았다.
염기서열로부터 유추한 68개의 아미노산 서열에는 다른 척추동물에서와 같이 Cys 잔기가 전체의 29.4% (20/68)로 풍부하였으며, MT의 특징인 Lys, Arg, His 등의 aromatic 잔기는 없었다(Fig. 1).
후속연구
따라서 Cu, Zn 등 생체 중금속 대사기능 유지와, 해로운 중금속의 해독 등 모든 생물체에서 그 기능이 잘 보존된 MT 유전자는 분자 진화적인 표지유전자로써, 그리고 환경오염의 biomaiker로 더 나아가 조절부위의 이용 가능성 등 그 유용성에 의거원시어류를 포함하여 보다 여러 어종들에서 다양한 연구들이 진행되어야 할 것으로 사료된다.
또한 MT의 발현은 중금속 뿐 아니라 glucocorticoid, catecholamine hormone 의 처리 (Bremner, 1991)와 기 아(McNamara and Buckley, 1994), 온도(Her - mesz et cd; 2001) 등에 의해서 MT의 발현 증가가보고되고 있으며, 이에 따라 무지개송어(Samson dal., 2001), 남극서식어류(Scudiero eW., 200]), stone loach와 pike (Olsson and Kille, 1997) 등에서 MT 유전자 발현에 대한 다양한 조절 부위에 대한 연구가진행되고 있다 이러한 조절부위에 대한 연구는 향후 신기능성 형질전환 어류 등의 제조를 위해 어류특이적인 유도 가능한 조절부위로 이용할 수 있을것이다.
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