Cerulenin 저항성 Aspergillus terreus 변이주로부터 lovastatin 생산을 위한 회분식과 유가식 배양 Batch and Fed-batch Fermentation for the Lovastatin Production by Cerulenin-resistant Aspergillus terreus Mutant원문보기
곰팡이 균인 Aspergillus terreus로서 고지혈증인 치료제인 lovastatin을 생산하기 위해 탄소원 조절에 의한 유가식 배양을 통해 lovastatin 생산 발효 조건을 확립하고자 하였다. 또한 발효시 곰팡이의 형태구조가 이차대사산물 생산에 중요함으로 유가식 배양에서의 공급배지농도와 공급속도에 따른 형태 구조의 변화가 생산성과 관련이 있는지를 구명하였다. Glucose 용액을 일정하게 또는 증가시켜 공급하는 방법을 실험하였으며 이 때 펠 의 분포를 비교하였다. Glucose 용액을 일정하게 공급한 경우가 1 mm 이하의 펠 이 더 많이 분포하였으며, lovastatin 생산량도 높았다. Lovastatin 생산에 적절한 펠 의 크기가 1 mm이었다는 연구 결과와 일치하였다. 또한 배양 방법 중 3일간 회분 배양 후 4일째부터 glucose를 일정하게 공급한 경우에서 높은 lovastatin 생산량을 나타내었다. 회분식 발효에서 lovastatin 생산을 위한 물리적 조건 중 교반 속도는 400 rpm으로 조절하였고 pH에 대한 영향을 조사하였다. 그 결과 pH 5.8로 유지하였을 때 lovastatin 생산량은 pH 7.4의 7배 이상인 384 mg/L로서 발효 기간 중 pH 조절이 중요하다는 것을 알 수 있었다. 플라스크에서의 유가식 배양과 회분식 배양결과를 토대로 하여 발효조에서 유가식 배양시 pH 5.8, 400 rpm, 초기 glucose 농도를 30 g/L 로 하여 3일간 회분 배양 후 4일째부터 180 g/L의 glucose 용액을 공급한 결과, 회분식 배양의 lovastatin 생산량보다 1.5배 많은 547 mg/L를 얻었으며, 생산성은 3.25 mg/L $\cdot$ hr였다.
곰팡이 균인 Aspergillus terreus로서 고지혈증인 치료제인 lovastatin을 생산하기 위해 탄소원 조절에 의한 유가식 배양을 통해 lovastatin 생산 발효 조건을 확립하고자 하였다. 또한 발효시 곰팡이의 형태구조가 이차대사산물 생산에 중요함으로 유가식 배양에서의 공급배지농도와 공급속도에 따른 형태 구조의 변화가 생산성과 관련이 있는지를 구명하였다. Glucose 용액을 일정하게 또는 증가시켜 공급하는 방법을 실험하였으며 이 때 펠 의 분포를 비교하였다. Glucose 용액을 일정하게 공급한 경우가 1 mm 이하의 펠 이 더 많이 분포하였으며, lovastatin 생산량도 높았다. Lovastatin 생산에 적절한 펠 의 크기가 1 mm이었다는 연구 결과와 일치하였다. 또한 배양 방법 중 3일간 회분 배양 후 4일째부터 glucose를 일정하게 공급한 경우에서 높은 lovastatin 생산량을 나타내었다. 회분식 발효에서 lovastatin 생산을 위한 물리적 조건 중 교반 속도는 400 rpm으로 조절하였고 pH에 대한 영향을 조사하였다. 그 결과 pH 5.8로 유지하였을 때 lovastatin 생산량은 pH 7.4의 7배 이상인 384 mg/L로서 발효 기간 중 pH 조절이 중요하다는 것을 알 수 있었다. 플라스크에서의 유가식 배양과 회분식 배양결과를 토대로 하여 발효조에서 유가식 배양시 pH 5.8, 400 rpm, 초기 glucose 농도를 30 g/L 로 하여 3일간 회분 배양 후 4일째부터 180 g/L의 glucose 용액을 공급한 결과, 회분식 배양의 lovastatin 생산량보다 1.5배 많은 547 mg/L를 얻었으며, 생산성은 3.25 mg/L $\cdot$ hr였다.
The biosynthesis of Lovastatin, a cholesterol lowering agent formed by the filamentous fungus, cerulenin-resistant Aspergillus terreus mutant was studied in shake flasks and bioreactors. The lovastatin production could be improved by fed-batch under the limited condition of carbon source. The relati...
The biosynthesis of Lovastatin, a cholesterol lowering agent formed by the filamentous fungus, cerulenin-resistant Aspergillus terreus mutant was studied in shake flasks and bioreactors. The lovastatin production could be improved by fed-batch under the limited condition of carbon source. The relationship between the fungal morphology and the lovastatin production was also examined during the fed-batch cultures. The fed-batch studies in shake flasks were carried out to find the optimum glucose feeding method, and the pulsed feeding of glucose from 3 days onward at 24 hours intervals was found to be optimal to increase the lovastatin production and reduce the average pellet size. When the pH was controlled at around 5.8 during the whole fermentation period, the lovastatin concentration reached 384 mg/L, which is much higher than the values obtained pH-uncontrolled and pH 7.4. The optimal glucose feeding strategies was found that 30 g/L of glucose was added initially in batch mode, and then fed-batch was conducted by continuous addition of glucose solution(180 g/L) from 72 to 240 hr at a rate of 1.2 mL/hr at $28^{\circ}C$, pH 5.8, 400 rpm, and 1.0 vvm. The lovastatin concentration of 547 mg/L was obtained in 168 hr. It was about 1.5 times higher than the value of the batch fermentation.
The biosynthesis of Lovastatin, a cholesterol lowering agent formed by the filamentous fungus, cerulenin-resistant Aspergillus terreus mutant was studied in shake flasks and bioreactors. The lovastatin production could be improved by fed-batch under the limited condition of carbon source. The relationship between the fungal morphology and the lovastatin production was also examined during the fed-batch cultures. The fed-batch studies in shake flasks were carried out to find the optimum glucose feeding method, and the pulsed feeding of glucose from 3 days onward at 24 hours intervals was found to be optimal to increase the lovastatin production and reduce the average pellet size. When the pH was controlled at around 5.8 during the whole fermentation period, the lovastatin concentration reached 384 mg/L, which is much higher than the values obtained pH-uncontrolled and pH 7.4. The optimal glucose feeding strategies was found that 30 g/L of glucose was added initially in batch mode, and then fed-batch was conducted by continuous addition of glucose solution(180 g/L) from 72 to 240 hr at a rate of 1.2 mL/hr at $28^{\circ}C$, pH 5.8, 400 rpm, and 1.0 vvm. The lovastatin concentration of 547 mg/L was obtained in 168 hr. It was about 1.5 times higher than the value of the batch fermentation.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
곰팡이 균인 Aspergillus terreus로서 고지혈증인 치료제인 lovastatin을 생산하기 위해 탄소원 조절에 의한 유가식 배양을 통해 lovastatin 생산 발효 조건을 확립하고자 하였다. 또한 발효시 곰팡이의 형태구조가 이차대사산물 생산에 중요함으로 유가식 배양에서의 공급배지농도와 공급속도에 따른 형태 구조의 변화가 생산성과 관련이 있는지를 구명하였다.
본 실험에서는 lovastatin 생산을 위한 균사 형성 곰팡이 Aspergillus terreus 변이주의 탄소원 조절에 의한 유가식 배양조건을 확립하고자 하였다. 또한 곰팡이의 형태구조가 이차대사산물 생산에 중요함으로 유가식 배양에서 탄소원의 공급 배지농도, 공급 시기와 공급 속도에 따른 균체의 형태구조의 변화가 lovastatin 생산성에 미치는 영향을 관찰하였다.
다른 탄소원보다 신속하게 대사되는 glucose와 같은 탄소원은 미생물의 성장에는 매우 좋은 영양분이지만 이차대사산물의 생산성에는 부정적인 영향을 미친다고 일반적으로 알려져 있다(19-21). 이러한 현상을 이화 대사 억제(catabolite repression/inhibition) 현상이라고 하며, lovastatin의 생합성시에도 발견되는지 조사하였다. 이를 위해 다양한 배지 공급 조건하에서 유가식 배양을 수행함으로써 그 결과를 동일한 배지조건의 회분식 배양과 비교하여, wild-type 균주와 cerulenin 저항성 균주와의 이화대사억제 현상 여부를 비교해 보고자하였다.
제안 방법
또한 발효시 곰팡이의 형태구조가 이차대사산물 생산에 중요함으로 유가식 배양에서의 공급배지농도와 공급속도에 따른 형태 구조의 변화가 생산성과 관련이 있는지를 구명하였다. Glucose 용액을 일정하게 또는 증가시켜 공급하는 방법을 실험하였으며 이 때 펠맅의 분포를 비교하였다. Glucose 용액을 일정하게 공급한 경우가 1 mm이하의 펠맅이 더 많이 분포하였으며, lovastatin 생산량도 높았다.
2% glycerol로 사면 배양한 포자를 수거하여, 종균배양을 위한 배지에 5%(v/v) 접종하여 8일간 200 rpm에서 진탕 배양하였다. Lovastatin 생산은 배양한 종균 1%(v/v)을 생산배지에 접종하여 lovastatin 생산 실험 조건에 의거 수행하였다. 배지는 당과 무기염류를 각각 분리하여 살균한 후, 무균 상태에서 혼합하여 사용하였다.
플라스크를 이용하여 실험을 하였다. Lovastatin 생산을 위한 유가식 배양 실험은 500 mL 삼각 플라스크를 이용하였으며, 초기 배지부피는 실험조건에 따라 80과 90 mL로 조절하여 발효를 수행하였다. 최종 조업부피는 100 mL이 되도록 조절하였으며, 온도 28 ℃와 200 rpm에서 8일간 수행하였다.
Petri dish에 10-30개 정도의 펠맅이 나타나도록 발효액 시료를 희석하여 비디오 카메라와 연결된 On-air 프로그램(사람과 셈틀, Korea)을 이용하여 카메라의 렌즈 위치를 고정시켜 영상을 컴퓨터로 입력하였다. 입력된 영상은 다시 Scion image(Scion corporation, USA) 프로그램을 이용하여 바탕화면과 펠맅을 구분하기 쉽게 명암을 조절한다.
5 L가 되도록 실험 계획에 의해 공급용액 적정량을 조절하여 공급하였다. 공기유량은 배양 부피에 따라 변화시켜주면서 전 발효기간 중 1 vvm이 되도록 공기의 공급속도를 조절하였다. 발효중 PPG(polypropylene glycol 2,000)를 소포제로 사용하였으며, 배양하는 동안에 배양액의 pH는 2N HC1 과 2N NaOH 용액을 사용하여 조절하였다.
균체농도를 측정하기 위하여 균질혼합기에서 균질화 과정을 거친 배양액 시료를 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상징액을 버린 후 증류수를 넣어 와류 혼합을 하고 다시 원심분리하는 세척과정(3번 반복)을 거친 후 105℃에서 항량을 구하여 건조균체량(dry cell weight, DCW)을 측정하였다. 발효 배양액의 잔류당은 Dinitrosalicyclic acid(DNS)를 이용한 환원당 측정 방법에 의해 측정하였다(14).
균체성장, 탄소원 소비경향과 lovastatin 생산 등의 기초자료를 얻기 위하여 플라스크를 이용한 회분식 배양 실험을 하였다. 생산배지에 접종을 위한 종배양은 250 mL의 플라스크에 80 mL의 배지를 넣어 진탕배양기에서 28℃와 200 rpm으로 8일간 수행하였다.
5 g/L, FeSO4 · 7H2O 용액(FeSO4 · 7H2O 10 g/L 용액) 1 mL/L이었다(1). 그리고 lovastatin 생산을 위한 생산배지의 조성은 wild-type 균주의 최적생산배지를 근거로 cerulenin 저항성 변이주의 생산배지를 최적화한 결과를 참고하여 결정하였으며, glucose 50 g/L, cottonseed oil 50 mL/L, yeast extract 2.5 g/L, K2HPO4 6 g/L, polyethlylene glycol(PEG) 2,000 2.5 g/L 이었다 발효조 배양시 pH는 2N NaOH와 2N HCl 로 조정하였다(12,13).
확립하고자 하였다. 또한 곰팡이의 형태구조가 이차대사산물 생산에 중요함으로 유가식 배양에서 탄소원의 공급 배지농도, 공급 시기와 공급 속도에 따른 균체의 형태구조의 변화가 lovastatin 생산성에 미치는 영향을 관찰하였다.
또한 발효시 곰팡이의 형태구조가 이차대사산물 생산에 중요함으로 유가식 배양에서의 공급배지농도와 공급속도에 따른 형태 구조의 변화가 생산성과 관련이 있는지를 구명하였다. Glucose 용액을 일정하게 또는 증가시켜 공급하는 방법을 실험하였으며 이 때 펠맅의 분포를 비교하였다.
유가식 배양시 공급하는 glucose 농도변화가 펠맅크기와 lovastatin 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 발효조 운전 조건으로 pH는 5.8, 교반속도는 400 rpm 그리고 공기 유량은 배양 부피에 따라 변화시켜주면서 전 발효기간 중 1 vvm 이 되도록 조절하였다.
공기유량은 배양 부피에 따라 변화시켜주면서 전 발효기간 중 1 vvm이 되도록 공기의 공급속도를 조절하였다. 발효중 PPG(polypropylene glycol 2,000)를 소포제로 사용하였으며, 배양하는 동안에 배양액의 pH는 2N HC1 과 2N NaOH 용액을 사용하여 조절하였다. 발효조 배양 실험을 위한 종배양은 성장 배지에서 8일간 배양하였으며, 조업부피의 l%(v/v)를 발효조에 접종하였다.
빠르게 대사되어 미생물의 성장에는 좋은 영양분이지만, 이차대사산물의 생산성에는 이화대사억제에 의해 부정적인 영향(21)을 미친다고 알려진 glucose에 대한 플라스크에서 유가식 배양을 한 후 lovastatin 생산과 발효 후 펠맅의 크기를 측정해 보았다.
발효조 배양 실험을 위한 종배양은 성장 배지에서 8일간 배양하였으며, 조업부피의 l%(v/v)를 발효조에 접종하였다. 성장배지의 성분이 이차대사산물의 생합성에 미치는 영향을 방지하기 위하여 종배양액을 원심분리하여 균체만 생산 배지에 접종하였으며, 접종시 펠맅의 크기는 평균 1.25 mm 정도이었다.
유가식 발효 중 발효조 벽면의 균체 부착 현상을 억제하기 위하여 교반속도(800 rpm)를 제외한 유가식 배양(A)와 같은 조건에서 유가식 발효를 수행하였다. 유가식 배양(A)과 비교하여 빠른 교반속도에 의한 전단력 영향으로 균체성장에 영향이 있을 것으로 예상하였으나, 발효초기의 균체 성장은 120시간까지 50 g/L를 유지하였으며, 균체성장과 lovastatin 생산은 유가식 배양 (A)와 큰 차이가 없었다.
유가식 배양에서 glucose의 총공급 농도는(배양기 내의 glucose 초기 량과 유가식 배양을 위하여 공급한 glucose 량을 농도로 환산) 50, 65, 80, 100과 120 g/L이 되도록 하였다. 유가식 배양에서 당의 공급은 timer를 사용하여 조절하였으며 timer의 on-off 기간을 0.
유가식 배양에서 glucose의 총공급 농도는(배양기 내의 glucose 초기 량과 유가식 배양을 위하여 공급한 glucose 량을 농도로 환산) 50, 65, 80, 100과 120 g/L이 되도록 하였다. 유가식 배양에서 당의 공급은 timer를 사용하여 조절하였으며 timer의 on-off 기간을 0.5분과 6.5분으로 하였다. 당의 공급은 연동펌프를 이용하여 공급하였고, 배양 초반부터 당을 공급하였으며 공급되는 유속은 0.
유가식 배양은 제한기질인 탄소원 공급 농도 및 시기에 따른 lovastatin 생산, 균의 성장과 펠맅 형태구조 연구를 위하여 플라스크를 이용하여 실험을 하였다. Lovastatin 생산을 위한 유가식 배양 실험은 500 mL 삼각 플라스크를 이용하였으며, 초기 배지부피는 실험조건에 따라 80과 90 mL로 조절하여 발효를 수행하였다.
유가식 배양의 초기 배양액의 부피는 1.3 L이었으며, 배양하는 동안 연동펌프(Cole-parmer instrument company, USA)를 이용하여 발효 후 총부피가 1.5 L가 되도록 실험 계획에 의해 공급용액 적정량을 조절하여 공급하였다. 공기유량은 배양 부피에 따라 변화시켜주면서 전 발효기간 중 1 vvm이 되도록 공기의 공급속도를 조절하였다.
유가식으로 공급되는 glucose의 농도(10, 30과 50 g/L), 유가식 배양시에 사용하는 배지의 glucose 농도와 glucose의 유가식 공급 시기 등을 변화시키는 유가식 배양 방법을 사용했다. 유가식 배양에서 glucose의 총공급 농도는(배양기 내의 glucose 초기 량과 유가식 배양을 위하여 공급한 glucose 량을 농도로 환산) 50, 65, 80, 100과 120 g/L이 되도록 하였다.
이러한 현상을 이화 대사 억제(catabolite repression/inhibition) 현상이라고 하며, lovastatin의 생합성시에도 발견되는지 조사하였다. 이를 위해 다양한 배지 공급 조건하에서 유가식 배양을 수행함으로써 그 결과를 동일한 배지조건의 회분식 배양과 비교하여, wild-type 균주와 cerulenin 저항성 균주와의 이화대사억제 현상 여부를 비교해 보고자하였다.
입력된 영상은 다시 Scion image(Scion corporation, USA) 프로그램을 이용하여 바탕화면과 펠맅을 구분하기 쉽게 명암을 조절한다. 인식된 펠맅의 크기는 화소(pixel)로 나타나게 되며, Excel (Microsoft, USA)의 피벗 테이블을 이용하여 같은 화소를 나타내는 펠맅의 수를 계산하였다. 정사각형(한 변의 길이 5 mm)과 펠맅이 나타내는 화소와의 관계식을 계산하여 펠맅의 직경을 구하였으며, 컴퓨터 화면에 나타난 펠맅의 영상은 Figure 1과 같다.
인식된 펠맅의 크기는 화소(pixel)로 나타나게 되며, Excel (Microsoft, USA)의 피벗 테이블을 이용하여 같은 화소를 나타내는 펠맅의 수를 계산하였다. 정사각형(한 변의 길이 5 mm)과 펠맅이 나타내는 화소와의 관계식을 계산하여 펠맅의 직경을 구하였으며, 컴퓨터 화면에 나타난 펠맅의 영상은 Figure 1과 같다.
플라스크에서의 회분식과 유가식 배양 결과를 토대로, 발효조에서 유가식 배양시 공급하는 glucose 농도변화가 펠맅크기와 lovastatin 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 발효조 운전 조건으로 pH는 5.
또한 배양 방법 중 3일간 회분 배양 후 4일째부터 glucose를 일정하게 공급한 경우에서 높은 lovastatin 생산량을 나타내었다. 회분식 발효에서 lovastatin 생산을 위한 물리적 조건 중교반 속도는 400 rptn으로 조절하였고 pH에 대한 영향을 조사하였다. 그 결과 pH 5.
대상 데이터
발효중 PPG(polypropylene glycol 2,000)를 소포제로 사용하였으며, 배양하는 동안에 배양액의 pH는 2N HC1 과 2N NaOH 용액을 사용하여 조절하였다. 발효조 배양 실험을 위한 종배양은 성장 배지에서 8일간 배양하였으며, 조업부피의 l%(v/v)를 발효조에 접종하였다. 성장배지의 성분이 이차대사산물의 생합성에 미치는 영향을 방지하기 위하여 종배양액을 원심분리하여 균체만 생산 배지에 접종하였으며, 접종시 펠맅의 크기는 평균 1.
Lovastatin 생산은 배양한 종균 1%(v/v)을 생산배지에 접종하여 lovastatin 생산 실험 조건에 의거 수행하였다. 배지는 당과 무기염류를 각각 분리하여 살균한 후, 무균 상태에서 혼합하여 사용하였다. 종배양을 위해 사용된 배지의 조성은 glucose 80 g/L, tryptone 40 g/L, urea 2 g/L, (NH4)실험에 사용된 발효조는 2.5 L 용량(조업부피 1.5 L)의 jar 형태 발효조(코바이오텍, Korea)로서 자동온도조절기, 교반속도조절기, 용존산소센서, pH센서와 소포제센서를 부착하고 있으며 자동으로 제어된다.
연구에 사용된 균주는 본 연구실에서 개발한 Aspergillus Zerrews(ATCC 20542)의 cerulenin 저항성 변이주이다(12).
이론/모형
배양액 중의 cottonseed oil의 함량은 solvent-extraction 방법으로 측정하였다(15). Lovastatin의 분석은 Roman Kysilka와 Vladiir Kren 등의 방법을 참고하여 HPLC로 분석하였다(16,17).
발효 배양액의 잔류당은 Dinitrosalicyclic acid(DNS)를 이용한 환원당 측정 방법에 의해 측정하였다(14). 배양액 중의 cottonseed oil의 함량은 solvent-extraction 방법으로 측정하였다(15).
발효 배양액의 잔류당은 Dinitrosalicyclic acid(DNS)를 이용한 환원당 측정 방법에 의해 측정하였다(14). 배양액 중의 cottonseed oil의 함량은 solvent-extraction 방법으로 측정하였다(15). Lovastatin의 분석은 Roman Kysilka와 Vladiir Kren 등의 방법을 참고하여 HPLC로 분석하였다(16,17).
영상해석(image analysis) 방법을 사용하여 펠맅의 크기를 측정하였다(18). Petri dish에 10-30개 정도의 펠맅이 나타나도록 발효액 시료를 희석하여 비디오 카메라와 연결된 On-air 프로그램(사람과 셈틀, Korea)을 이용하여 카메라의 렌즈 위치를 고정시켜 영상을 컴퓨터로 입력하였다.
성능/효과
Figure 5에 나타냈다. 50~120 g/L의 모든 glucose 농도를 살펴볼 때, lovastatin의 생산성이 유가식 배양보다 회분식배양에서 2배정도 높은 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과로부터 wild-type의 경우 glucose의 농도가 증가하면, lovastatin 생산에 관련된 유전자의 발현이 저해되거나, 또는 lovastatin 생합성 효소의 활성이 감소함으로 인해 lovastatin의 생산이 작아지는 것을 알 수 있으며, 이러한 생합성 감소 현상은 탄소 원의 유가식 공급으로도 잘 회복되지 않는 것으로 판단되었다.
Glucose 용액을 일정하게 또는 증가시켜 공급하는 방법을 실험하였으며 이 때 펠맅의 분포를 비교하였다. Glucose 용액을 일정하게 공급한 경우가 1 mm이하의 펠맅이 더 많이 분포하였으며, lovastatin 생산량도 높았다. Lovastatin 생산에 적절한 펠맅의 크기가 1 mm이었다는 연구 결과와 일치하였다.
8로 조절한 경우보다 대체적으로 펠맅의 크기가 크고 다양하게 분포하였다. pH를 조절하지 않은 경우는 발효 시작 후 24 시간부터는 펠맅과 균사체가 배양액 중에 존재하였으며, 발효 종료 후 균사체와 펠맅의 함량을 보면 9:1의 비율로 균사체가 많았다. 그리고 펠맅 크기는 약 1.
최종 용존산소는 회분식의 경우 23%이었으며, 유가식 배양은 공급탄소원의 농도에 따라유가식 배양(A)는 약 80%, 유가식 배양(B)는 약 50%를 유지하였다. 고농도의 glucose를 공급한 유가식 배양(C)를 제외하고 제한기질의 조절로서 발효기간 중 용존산소를 높게 유지하는 것이 가능할 것으로 판단되었다(Figure 9).
교반속도 400 rpm과 pH를 조절하지 않은 경우의 lovastatin 생산은 48시간 이후부터 시작되었고, 발효 시작 후 216시간에 173 mg/L으로 가장 높았으며 이후 감소하는 경향을 보였다. pH 5.
회분식 발효에서 lovastatin 생산을 위한 물리적 조건 중교반 속도는 400 rptn으로 조절하였고 pH에 대한 영향을 조사하였다. 그 결과 pH 5.8로 유지하였을 때 lovastatin 생산량은 pH 7.4의 7 배 이상인 384 mg/L로서 발효 기간 중 pH 조절이 중요하다는 것을 알 수 있었다. 플라스크에서의 유가식 배양과 회분식 배양결과를 토대로 하여 발효조에서 유가식 배양시 pH 5.
5배정도 높게 나타난 것이다. 그러나 168시간이후부터 lovastatin 생산이 감소하는 경향을 보여 주었으며, lovastatin 생산의 급격한 감소 시기와 발효조 배양액의 균체량이 많이 감소하는 시기는 일치하였다. 또한 균체가 감소하는 시기와 같은 시기에 발효조 벽면에 부착되는 균체가 급격하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, lovastatin 생산이 감소하는 것을 설명할 수 있는 중요한 현상으로 판단되었다.
이 결과로부터 wild-type의 경우 glucose의 농도가 증가하면, lovastatin 생산에 관련된 유전자의 발현이 저해되거나, 또는 lovastatin 생합성 효소의 활성이 감소함으로 인해 lovastatin의 생산이 작아지는 것을 알 수 있으며, 이러한 생합성 감소 현상은 탄소 원의 유가식 공급으로도 잘 회복되지 않는 것으로 판단되었다. 그러므로 본 실험에 사용한 wild-type 균주는 glucose에 대해 이화대사억제 현상이 있는 것으로 판단되었다.
그러므로 평균 1.25 mm의 작은 펠맅형태로 종 배양을 하여 발효조에 접종하였으나 발효 시작 후 펠맅과 균사체가 공존하는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 발효 중 균사체의 증가로 발효 말기에 균사체의 비율이 높아지는 경향을 보였다.
25 mm의 작은 펠맅형태로 종 배양을 하여 발효조에 접종하였으나 발효 시작 후 펠맅과 균사체가 공존하는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 발효 중 균사체의 증가로 발효 말기에 균사체의 비율이 높아지는 경향을 보였다. 펠맅형태로 배양되고 있는 플라스크 배양보다 발효조에서의 lovastatin 생산이 감소하는 이유는 발효조에서의 발효중 균사체의 증가로 인한 발효액의 점성 증가와 낮은 산소전달속도 현상으로 생각된다.
저항성 균주의 경우에는 50~120 g/L의 모든 glucose 농도를 살펴볼 때, lovastatin의 생산성이 wild-type과는 반대로, 회분식 배양보다 유가식 배양에서 대부분 높은 lovastatin 생산성을 관찰할 수 있었다 또한 주목할 점은 glucose의 농도가 증가할수록 lovastatin 생합 성량이 감소하는 경향을 보이기는 하지만 유가식 배양을 동일한 농도의 회분식 배양과 비교할 때 glucose 총공급 농도가 커짐에 따라(65 - 120 g/L), 유가식 배양의 생산성이 공급하는 glucose 농도가 50 g/L인 경우를 제외하고 회분식 배양에 비해 뚜렷하게 높게 나타난 점이다. 따라서 cerulenin 저항성 변이주가 wild-type 균주보다 탄소원에 대한 이화대사억제 현상에 덜 민감한 균주이며, 또한 유가식 배양을 통해 생산성 저해 현상을 어느 정도 극복할 수 있는 균주임을 알 수 있었다.
그러나 168시간이후부터 lovastatin 생산이 감소하는 경향을 보여 주었으며, lovastatin 생산의 급격한 감소 시기와 발효조 배양액의 균체량이 많이 감소하는 시기는 일치하였다. 또한 균체가 감소하는 시기와 같은 시기에 발효조 벽면에 부착되는 균체가 급격하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, lovastatin 생산이 감소하는 것을 설명할 수 있는 중요한 현상으로 판단되었다. 발효 시작 후 120시간이 지난 경우, 유가식 배양과 회분식 배양에서의 lovastatin 생산은 약 300 mg/L로서 비슷하였다.
Lovastatin 생산에 적절한 펠맅의 크기가 1 mm이었다는 연구 결과와 일치하였다. 또한 배양 방법 중 3일간 회분 배양 후 4일째부터 glucose를 일정하게 공급한 경우에서 높은 lovastatin 생산량을 나타내었다. 회분식 발효에서 lovastatin 생산을 위한 물리적 조건 중교반 속도는 400 rptn으로 조절하였고 pH에 대한 영향을 조사하였다.
발효조에서 유가식 배양을 수행한 결과 pH 5.8, 400 rpm, 초기 glucose 농도를 30 g/L로 하여 3일간 회분 배양 후, 4일째부터 180 g/L의 glucose 용액을 공급하는 것이 lovastatin 생산을 위한 최적조건이었다. 회분식 발효조 배양 보다 1.
플라스크에서 배양한 결과의 약 67%에 해당하는 lovastatin 생산을 보여주었다. 배양액 중의 용존산소는 균체의 증가로 인한 산소 요구량이 증가되어 발효 후 24시간에서 용존산소가 급격히 떨어져 포화 용존산소의 20% 수준이었으며, 균체 성장이 정상 상태에 이르렀을 때 80%까지 높아졌다가 발효 말기까지 서서히 감소하는 경향을 보여주었다. 탄소원인 glucose의 농도 변화는 균체의 빠른 성장으로 인하여 48시간에 약 12 g/L까지 감소하였으며, 특히 cottonseed oil은 플라스크 배양 결과보다 급격하게 감소하는 소비 경향을 나타냈다(자료 미제시).
생산 배지에 평균 1.25 mm의 펠맅을 접종하였음에도 불구하고, pH 5.8과 7.4 모두 24시간 이후부터 균사체와 펠맅이 같이 자라기 시작하였으며, 72시간 이후에는 펠맅의 수보다 균사체의 함량이 더 증가하였다. 최종 펠맅의 크기는 pH 5.
유가식 발효를 수행하였다. 유가식 배양(A)과 비교하여 빠른 교반속도에 의한 전단력 영향으로 균체성장에 영향이 있을 것으로 예상하였으나, 발효초기의 균체 성장은 120시간까지 50 g/L를 유지하였으며, 균체성장과 lovastatin 생산은 유가식 배양 (A)와 큰 차이가 없었다. 그러나 배양초기 펠맅의 모양은 원형이었으나, 과도한 교반으로 인하여 대부분 펠맅이 깨어진 형태의 불규칙한 모양을 나타냈다 또한, 120시간이 지난 후 균체가 상단 벽에 부착되는 현상으로 발효조 내의 균체가 급격히 감소하는 경향을 보여주었으며 발효를 중단하였다(자료 미제시).
50~120 g/L의 모든 glucose 농도를 살펴볼 때, lovastatin의 생산성이 유가식 배양보다 회분식배양에서 2배정도 높은 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과로부터 wild-type의 경우 glucose의 농도가 증가하면, lovastatin 생산에 관련된 유전자의 발현이 저해되거나, 또는 lovastatin 생합성 효소의 활성이 감소함으로 인해 lovastatin의 생산이 작아지는 것을 알 수 있으며, 이러한 생합성 감소 현상은 탄소 원의 유가식 공급으로도 잘 회복되지 않는 것으로 판단되었다. 그러므로 본 실험에 사용한 wild-type 균주는 glucose에 대해 이화대사억제 현상이 있는 것으로 판단되었다.
결과를 Figure 6에 나타냈다. 저항성 균주의 경우에는 50~120 g/L의 모든 glucose 농도를 살펴볼 때, lovastatin의 생산성이 wild-type과는 반대로, 회분식 배양보다 유가식 배양에서 대부분 높은 lovastatin 생산성을 관찰할 수 있었다 또한 주목할 점은 glucose의 농도가 증가할수록 lovastatin 생합 성량이 감소하는 경향을 보이기는 하지만 유가식 배양을 동일한 농도의 회분식 배양과 비교할 때 glucose 총공급 농도가 커짐에 따라(65 - 120 g/L), 유가식 배양의 생산성이 공급하는 glucose 농도가 50 g/L인 경우를 제외하고 회분식 배양에 비해 뚜렷하게 높게 나타난 점이다. 따라서 cerulenin 저항성 변이주가 wild-type 균주보다 탄소원에 대한 이화대사억제 현상에 덜 민감한 균주이며, 또한 유가식 배양을 통해 생산성 저해 현상을 어느 정도 극복할 수 있는 균주임을 알 수 있었다.
하였다. 초기 4.5 g/90 mL의 glucose를 공급한 조건하에서 3일간 회분 배양 후, 4일째부터 하루에 2.5 mL(5 g/10 mL) 씩 공급한 결과 회분식 배양과 균체량은 비슷하였으나, 예상과는 달리 lovastatin 생산량은 상당히 낮은 220 mg/L 값을 보였다. 발효 후 펠맅의 크기는 Figure 7과 같이 0.
배양액 중의 용존산소는 균체의 증가로 인한 산소 요구량이 증가되어 발효 후 24시간에서 용존산소가 급격히 떨어져 포화 용존산소의 20% 수준이었으며, 균체 성장이 정상 상태에 이르렀을 때 80%까지 높아졌다가 발효 말기까지 서서히 감소하는 경향을 보여주었다. 탄소원인 glucose의 농도 변화는 균체의 빠른 성장으로 인하여 48시간에 약 12 g/L까지 감소하였으며, 특히 cottonseed oil은 플라스크 배양 결과보다 급격하게 감소하는 소비 경향을 나타냈다(자료 미제시).
25 mg/L·hr이였다. 펠맅의 크기도 lovastatin 생산을 위한 최적크기로 제시된 1 mm보다(22) 약간 큰 평균 2 mm 이하로 발효 기간 중 유지할 수 있었다.
4의 7 배 이상인 384 mg/L로서 발효 기간 중 pH 조절이 중요하다는 것을 알 수 있었다. 플라스크에서의 유가식 배양과 회분식 배양결과를 토대로 하여 발효조에서 유가식 배양시 pH 5.8, 400 rpm, 초기 glucose 농도를 30 g/L로 하여 3일간 회분 배양 후 4일째부터 180 g/L의 glucose 용액을 공급한 결과, 회분식 배양의 lovastatin 생산량보다 1.5배 많은 547 mg/L를 얻었으며, 생산성은 3.25 mg/L·hr였다.
회분식 배양과 시간에 따른 용존산소를 비교해 보면(Figure 4의 pH 5.8), 균체성장이 빠른 초기에는 두 발효 방법 모두 24시간 안에 용존산소가 감소하는 경향을 보이며(회분식은 약 27%, 유가식 배양은 약 40~50%), 그후 증가하였다가 다시 감소하는 경향을 보여주었다. 최종 용존산소는 회분식의 경우 23%이었으며, 유가식 배양은 공급탄소원의 농도에 따라유가식 배양(A)는 약 80%, 유가식 배양(B)는 약 50%를 유지하였다.
후속연구
Cerulenin 저항성 Aspergillus terreus 변이주로 부터 lovastatin생산을 위한 유가식 배양은 발효조 벽면에 균체가 부착되는 현상을 억제할 수 있는 방법 또는 균체의 펠맅 유지(발효 중 생성되는 균사 방지)를 위한 생산배지와 발효조건의 연구가 필요하다고 생각되었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.