선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 EMT-6 세포를 이용하여 유기수은의 세포 면역독성에 대한아연의 방어효과 및 기전을 알아보기 위하여 세포의 NO와 ATP 생성량을 독성지표로 이용하였고 각 실험조건에서 세포 내 GSH 농도와 세포 내로 유입된 수은의 양을 측정하여 아연의 방어기전을 밝히고자 하였다. 또한 GSH 합성을 억제하는 BSO와 GSH 보호물질인。丁丁를 전처리하여 아연의 방어기 전에 있어서 GSH의 역할을 알아보았다.
- 이 연구에서는 EMT-6 세포를 이용하여 수은의 세포 면역독성에 대한아연의 방어효과와 그 기전을 살펴보고 이러한 방어기 전에 있어서 GSH의 역할을 밝히기 위해 실시하였다. 이를 위해 -SH기 보호 물질로 알려진 dithiothreitol (DTT)와 세포 내 GSH를 선택적으로 억제할 수 있는 buthionine sulfoximine (BSO) 을 유기 수은 (methylmercury chloride ; CHsHgCl) 또는 아연 (zinc chloride ; ZnC12)과 여러 실험조건으로 처리하여 세포 면 역반응 의 지표인 NO 생성량과 세포내 ATP 및 GSH를 측정하였고 실험조건에 따른 세포 내수은농도를 직접 정 량하였다.
- 있으리라 사료된다. 이러한 효과를 알아보기 위해 이 연구에서는 세포막투과가 용이하여 세포 내 GSH 농도에 영향을 미칠 수 있는 두 물질을 첨가하여 결과를 관찰하였다. GSH 보호물질인 DTT는 세포막 투과가 용이하고 -SH기를 풍부하게 함유하고 있는 물질로-SH기와 친화성이 있는 독성물질이 세포 내로 유입되면 독성물질에 우선적으로 결합하여 세포 내 GSH를 보호한다.
제안 방법
- EMT-6 세포 내 축적된 수은의 농도를 측정하기 위한 전처리는 수거한 세포를 냉각기가 부착된 Elenmeyer flask에 담아 H2SO4—HNO3-HCIO4를가하고 200°C의 sand bath에서 가열 분해하여 KMN04의 색이 10분간 남을 때까지 반복한 후, 다시 40°C로 냉각하고, NH20H-HC1 용액(20% w/v)을가하여 KMNCH를 제거하였다.전처리가 끝나 시료에 3차 증류수를 첨가하여 최종 용적 100 畝로 만들고 이것에 10% w/v의 SnC12를 가하여 수은 농도를 측정하였다.
- BSO와 GSH 보호물질인。丁丁를 전처리하여 아연의 방어기 전에 있어서 GSH의 역할을 알아보았다.
- 배양액 50 以씩을 취해 microtiter plate에 옮기고 100 以의 Griess reagents (1:1 mixture of 0.1% N— 1 -naphthylethylenediamine dihydro chloride in 60% acetic acid, and 1% sulfonilamide in 30% acetic acid) 를 혼합하여 microtiter plate에 혼합한 다음 ELISA reader(Dynatech, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 배양액내의 NCte-는 동 일한 방법으로 sodium nitrate (NaNC)2)를 l~100“M의 범위에서 흡광도를 측정하여 만들어진 표준 곡선 (standard curve)을 이용하여 구하였다.
- 10분간 원심분리하였다. 분리된 상층액 20 以 을 100 mM glycine 80 以와 혼합한 다음 0.1% luciferase 100 以을 첨가한 후 luminometer (Berthold, Germany) 를 이용하여 luciferase와 ATP 의 반응에 따른 발광정도를 측정하였고, 0.1-10 n M 의 범위 내의 표준 곡선을 이용하여 ATP 양을 계산하였다.
- 배양된 세포(5X106)를 수거하여 500xg, 、。에서 5분간 원심분리하여 분리한 후 초음파 분쇄기를 이용하여 세포를 파괴시킨 다음 10, 000xg> 4°C에서 10분간 원심분리하였다. 분리된 상층액과 동량의 10% metaphosphoric acid (MPA) 를 혼합하여 다시 10, 000xg, 4°C에서 8분간 원심분리한 다음 상층액에서 GSH assay kit를 이용하여 GSH을 측정 하였다.
- 사전 실험을 통해 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 DTT와 BSO 농도((Sigma Chemical Co., USA, 10-50 it M)를 첨가하여 48시간 배양한 후 세포 내 GSH 농도를 측정하였고, 같은 농도의 DTT와 BSO 를 전처리 하여 12시간을 배양한 후 유기수은 (8 “M) 을 첨가하여 NO와 ATP 농도를 측정 하였다.
- 이상의 생존율을 유지하며 N。생성을 현저히 감소시키는 수은 농도(8 n M) 에 동일 농도의 아연(8 “ M) 을 동시 첨가하였고, 수은에 대한 세포 내 아연의 효과만을 알아보기 위해서 아연 (8 “ M)을 전처리하여 12시간을 배양한 후 유기수은 (8 “ M) 을 첨가하여 48시간 배양하였다.
- 세포 내 GSH농도 측정은 GSH assay kit(Calbio- chem, USA ; cat. #354102)을 이용하여 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 GSH를 정량하였다. 배양된 세포(5X106)를 수거하여 500xg, 、。에서 5분간 원심분리하여 분리한 후 초음파 분쇄기를 이용하여 세포를 파괴시킨 다음 10, 000xg> 4°C에서 10분간 원심분리하였다.
- 아연처리 방법에 의한 세포 내 유기수은의 축적량 변화는 유기수은(8 * M) 에 0.5~8 n M 농도의 아연을 동시 첨가하여 48시간을 배양하거나 아연을 전처리하여 12시간을 배양한 후 유기수은(8 “M)을 첨가하여 다시 48시간을 배양하여 각각의 경우에서의 세포 내수은농도를 측정 하였다.
- 유기수은 (Kanto Chemical Co., Japan) 과 아연 (Fluka AG, Swiss)< 세포 생존율이 90% 이상 유지되는 농도 이하에서 각각 0.5, 1, 2, 4, 8 “ M의 농도로첨 가하여 48시간 배양하였다.
- 이 연구에서 아연은 실험에 이용된 농도(8 “M 이하)에서는 NO2-및 ATP의 생성에는 영향을 주지 않아 독성을 나타내지 않으나 세포 내 GSH 농도를 증가시켰다. 아연을 수은과 동시에 첨가하거나 아연을 전처리한 후수은을 첨가한 배양조건에서는 NOW, ATP 및 GSH의 생성량이 수은의 단독 첨가 때보다 현저히 증가하였다.
- 위해 실시하였다. 이를 위해 -SH기 보호 물질로 알려진 dithiothreitol (DTT)와 세포 내 GSH를 선택적으로 억제할 수 있는 buthionine sulfoximine (BSO) 을 유기 수은 (methylmercury chloride ; CHsHgCl) 또는 아연 (zinc chloride ; ZnC12)과 여러 실험조건으로 처리하여 세포 면 역반응 의 지표인 NO 생성량과 세포내 ATP 및 GSH를 측정하였고 실험조건에 따른 세포 내수은농도를 직접 정 량하였다.
- KMNCH를 제거하였다.전처리가 끝나 시료에 3차 증류수를 첨가하여 최종 용적 100 畝로 만들고 이것에 10% w/v의 SnC12를 가하여 수은 농도를 측정하였다. 전처리 및 측정 과정에 쓰인 시약은 모두 유해 금속 측정용 및 원자흡광분석용을 사용하였으며, 기기는 atomic absorption spectrophotometer (AAS, 선일옵트론, 한국)에 mercury vaporizer를 부착하여 측정하였다.
대상 데이터
- EMT-6 세포의 기본 배양은 10% FBS-DMEM에 IL— 1 (Sigma Chemical Co.), IFN-/ (Sigma Chemical Co.) 을 각각 40 U/m£, 20 U/畝로 첨가하여 배양하였다.
- 그러나 이러한 연구 결과들은 대부분이 쥐의 신장이 나 간장의 조직을 이용한 것으로 수은의 세포 수준에서의 면역독성에 대한 아연의 방어기전을 설명하는 데는 미흡하다. 이 연구에서 이용하고 있는 EMT-6 세포주는 마우스의 유선암에서 기원한 세포주로서 cytokine의 자극으로 세포성 면역세포인 대식세포보다 많은 양의 NO를 생성할 수 있어 일반적으로 세포성 면역 변조에 대한 독성검정을 알아보기 위한 실험 모델로 이용하고 3.10.25, 26) 있다.
데이터처리
- ), combined addition of 8 /z M CHsHgCl and ZnCh (Q), or 8 " M CHsHgCl only addition (△) for 48 hours. Values are expressed as mean and S.D. *Significantly different from the value of control value at p<0.05 by t-test.
- 측정자료들의 각 실험군 간의 차이 및 각 처리 군에서의 농도에 따른 차이의 비교는 Student's t-test 또는 AN0VA 및 Sheffe's test를 이용하였다.
이론/모형
- 반감기가 극히 짧은 N。를 대신하여 그 대사물인 NO「를 측정하므로써 유추하는 Hibbs 등物 의 방법에 따랐다.
성능/효과
- EMT-6 세포에 8 “ M 아연과 8/z M의 유기수은을 동시 첨가한 경우 나아연을 전처리한 후 유기수은을 첨가한 경우 모두에서 유기수은 만을 단독 첨가한 경우보다 NO2", ATP 및 GSH 농도는 현저히 증가하였으며 증가 정도는 아연을 전처리한 경우에서 더 확연하였다.
- 유기수은(0.5~8 “ M) 을 단독 첨가한 배양조건에서 EMT-6 세포의 N02-(83.7-74.9 " M) 및 ATP (6.6~2.8 it M) 생성량은 첨가한 양에 따라 용량의존적으로 현저히 감소하였고 (p<0.05), GSH의 생성량은 2 “ M이상의 농도에서부터 대조군(27.8 it M)보다 현저히 감소하여 (p<©05) 8 수은농도에서는 18.7 it M을 나타내었다(Fig. 1). 아연을 단독 첨가한 배양조건에서는 N02-와 ATP 생성량은 첨가한 농도에 관계없이 대조군과 유사하였고, GSH 생성량은 첨가한 아연의 양에 따라 용량의존적으로 증가하는 경향을 보였다 (Fig.
- EMT-6 세포에 8 0 M 아연과 8 〃 M의 유기수은을 동시 첨가한 경우 나 아연을 전처리한 후 유기수은을 첨가한 경우, 모두 유기수은 만을 단독 첨가한 경우보다 NOW, ATP 및 GSH 농도는 유기수은 만을 첨가한 경우보다 현저히 증가하였다 (p<0.05). 그러나 증가 정도는 아연을 전처리한 경우가 아연과 유기수은을 동시 첨가한 경우보다 더 현저하여 대조군(기본 배양조건) 수준으로 회복되었다(p<0.
- 있다. L2)그 중에 면역계에 대해서는 cytokines에 의해 활성화된 대식세포 및 중성구와 기타 염증 반응에 동원되는 면역세포 등에 의해 생성되어 외부에서 침입한 세포 내 미생물이나 종양세포에 대한 저항성을 높여주는 주요 면역방어인자L345）임 이 밝혀졌다. 한편, 특정 병원체에 감염된 실험동물은 체내의 면역세포들이 생성하는 NO량（量）에 따라 저항성 또는 감수성이 결정6‘7‘&9）되는데, Evans 등力은 종（種）에 따라 서로 다르게 관찰되는 감수성과 병변의 진행 정도도 유전적으로 NO 생성능력의 차이로 설명하면서 N。를 면역반응의 분자생물학적 지표로 이용하고 있다
- M의。丁丁를전처 리 하여 12시간을 배양한 후 8 “ M의 유기 수은을 첨가하였을 때 세포의 N0『, ATP 생성량은 유기수은 단독 첨가시의 현저했던 감소(Fig. 1)가 대조군 수준(82.9 p. M)으로 회복되었으며, 40 “ M 이상의 DTT 농도에서의 ATP 생성량은 8.0-8.8 “ M로 대조군의 7.3 卩 M보다 높았다(p<0.05). 한편, 같은 실험조건으로 BSO를 전처리 한 경우 세포의 N02-, ATP 생성량은 첨가한 BSO 농도에 용량 의존적으로 감소하였고(N02- : 84.
- 켰다. 또한 DTT 및 BSO를 전처리한 후 독성효과가 뚜렷히 나타나는 농도의 (8 n M) 수은을 첨가하였을 때 DTT를 전처리한 경우에는 N02-및 ATP가 대조군의 수준으로 유지되는데 BSO를 전처리한 경우에는 NQ厂 및 ATP는 수은 단독 첨가 조건보다도 더 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 수은의 면역독성이 주로 세포 내 GSH 농도 감소에 의한 것임을 알 수 있다.
- 05). 또한 아연을 전처리한 후 유기수은을 첨가한 배양조건에서도 역시 아연과 유기수은을 동시에 첨가한 실험조건과 유사한 양상으로 세포 축적량이 감소하였으며 (p<0.05) 감소 정도는 아연 전처리 조건에서 (31.8~ll.7ppm) 더 현저하였다 (Fig. 3).
- 세포 내 GSH 농도에 영향을 주는 물질을 첨가한 배양 조건에서, 세포 내 GSH 농도는 DTT 첨가 시에는 대조 군 수준으로 유지되거나 높았으나 BSO를 첨가한 경우에는 현저하게 감소하였다. 이러한 결과는 DTT 또는 BSO를 전처리한 후 유기수은을 첨가한 조건에서도 비슷한 양상으로 나타났으며, 특히 BSO 전처리 조건에서의 세포의 N02-, ATP 생성량은 첨가한 BSO 농도에 용량의존적으로 감소하였고 감소 정도는 수은을 단독 첨가한 경우보다 더 현저하였다.
- 아연과 유기수은을 동시에 첨가한 실험조건은 8 “ M의 유기수은만을 첨가한 군(38.3 ppm) 과 비 교하여 첨가한 아연의 농도 증가에 따라 세포 내 축적량이 35.2-18.9 ppm 범위로 현저하게 감소하였다 (p<0.05). 또한 아연을 전처리한 후 유기수은을 첨가한 배양조건에서도 역시 아연과 유기수은을 동시에 첨가한 실험조건과 유사한 양상으로 세포 축적량이 감소하였으며 (p<0.
- 1). 아연을 단독 첨가한 배양조건에서는 N02-와 ATP 생성량은 첨가한 농도에 관계없이 대조군과 유사하였고, GSH 생성량은 첨가한 아연의 양에 따라 용량의존적으로 증가하는 경향을 보였다 (Fig. 1).
- 아연을 수은과 동시에 첨가하거나 아연을 전처리한 후수은을 첨가한 배양조건에서는 NOW, ATP 및 GSH의 생성량이 수은의 단독 첨가 때보다 현저히 증가하였다. 따라서 수은에 대한 아연의 방어기전은 전체적으로 아연에 의한 세포 내 GSH 농도히증가와 밀접한 관계를 지니고 있는 것으로 나타났으며 그간의 생체를 대상으로 한 연구결과에서 와 마찬가지로 수은의 면역 독성에 대해서도 아연은 방어 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- 연구 결과, 수은을 단독 첨가한 조건에서 NQT농도는 염정호의 연구결과와 마찬가지로 대조군에 비해 용량의존적으로 현저히 감소하여 그간 보고된 생체에서의 수은에 의한 세포성 면역의 감소는 세포 수준에서도 적용될 수 있으며 생체에서의 수은의 면역독성은 NO와 관련이 있음을 유추할 수 있다.
- 유기수은을 단독 첨가한 배양조건에서 N02~, ATP 및 GSH 생성량은 대조군에 비해 용량 의존적으로 현저히 감소하였다. 아연은 EMT-6 세포의 NO2~, ATP 생성량에는 영향을 주지 않는 농도에서 GSH의생성 량을 용량의존적으로 증가시 켰다.
- 투과율이 낮은 것으로 알려져47) 있다. 이 연구에서도 수은 단독 첨가시의 억제되었던 NO「, ATP 및 GSH의 생성은 아연을 수은과 동시 첨가할 때보다 아연을 전처리한 군에서 확연하여 대조군 수준으로 회복되었다. 이것은 두 물질의 동시 첨가시에는 세포 내 이동이 빠른 수은에 의한 독성효과가 먼저 발현되고 세포 내 유입 속도가 느린 아연의 방어효과는 완전하게 발휘되지 못하여 나타난 때문이며, 아연의 전처리에서 수은에 대해 방어효과가 완전하게 나타나는 것은 아연의 전처리 후 충분한 시간의 경과로 아연의 세포 내 이동이 충분하게 이루어지므로써 아연에 의한 세포 내 GSH 농도 증가도 충분하여 방어효과가 완전하게 나타난 결과이다.
- 경우에는 현저하게 감소하였다. 이러한 결과는 DTT 또는 BSO를 전처리한 후 유기수은을 첨가한 조건에서도 비슷한 양상으로 나타났으며, 특히 BSO 전처리 조건에서의 세포의 N02-, ATP 생성량은 첨가한 BSO 농도에 용량의존적으로 감소하였고 감소 정도는 수은을 단독 첨가한 경우보다 더 현저하였다.
- 이러한 연구결과들로부터, 생체에서의 수은에 의한 세포성면역의 감소는 NO 생성 감소와 관련이 있음을 유추할 수 있다. 또한 수은의 면역 독성에 대한 아연의 방어기전은 주로 세포 내(內)에서 발현되고 있으며 그 기전은 세포 내로 유입된 아연이 세포 내 GSH농도를 증가시키고, 반응 산소기 (reactive oxygen intermediates, ROD 나 기타 free radical 등의 독성물질에 대한 방어기전과 마찬가지로2。印)증가된 세포 내 GSH가 수은과 결합하여 수은을 세포 외 (外)로 배출시키거나 제거하므로써 세포 내 (內) 수은 농도를 감소시켜 이루어지는 것으로 사료된다.
- 이상의 결과, 수은의 면역 독성에 대한 아연의 방어기전은 GSH의 대사과정과 밀접한 관련이 있으며 그기전에 있어서 아연 이 유기수은과 직접 결합하여 수은의 세포 내 유입을 방해하는 것보다는 아연이 세포 내 GSH의 생성을 증가시키면 GSH는 세포 내로 유입된 수은과 결합하여 수은의 세포외 (外) 배출 또는 제거를 촉진하므로써 세포 내 (內) 수은 농도를 감소 시켜 이루어지는 것으로 사료된다.
- 05). 한편, 같은 실험조건으로 BSO를 전처리 한 경우 세포의 N02-, ATP 생성량은 첨가한 BSO 농도에 용량 의존적으로 감소하였고(N02- : 84.2-35.7 卩 M, ATP : 7.3~2.5 “ M) 20 “ M 이상의 농도에서 감소 정도는 대조 군에 비 해현저 하였으며(p<0.05) 감소 정 도는 수은을 단독첨가한 경우(Fig. 1)보다 더 현저하게 나타나 상승효과를 보여주었다 (Fig. 5).
후속연구
- 있다.纣2» 따라서 세포의 수은에 의한 adenosine triphosphate (ATP) 생성의 변화를 살펴봄으로써 수은에 의한 독성과정이 에너지 대사에 미치는 영향을 알아볼 수 있을 것이다.
- 따라서 면역능과 밀접한 관련이 있는 NO의 생성과 활성도의 적절한 조절은 여러 가지 면역반응과 관련된 질환의 병인을 이해하고 치료하는 데 도움을 줄 것 이다
- 따라서 세포막투과가 용이하여 세포 내 GSH 농도에 영향을 줄 수 있는 물질들을 EMT-6 세포의 기본배양조건에 수은 및 아연과 함께 여러 조건으로 첨가하여 세포 내 GSH의 변화에 따른 수은 독성 의 변화양상을 관찰한다면, 세포 내 (內)에서의 수은 독성 의 발현과 이에 대한 GSH와 관련된 아연의 방어 효과를 알 수 있으리라 사료된다. 이러한 효과를 알아보기 위해 이 연구에서는 세포막투과가 용이하여 세포 내 GSH 농도에 영향을 미칠 수 있는 두 물질을 첨가하여 결과를 관찰하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.