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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 RG-m가 SOS 반응의 유도를 저해 하였는지를 조사하였고, 또한 4NQO에 대한 세포 내 항돌연변 이 기작을 해석하고자 DNA 수복의 경로가 다른 E. coli B/r 변이 주들을 사용하여 4NQ0 와 MNNG(7V-methyl-N-mtro-/V nitrosoguanidine)에 대한 항돌연변이원성 및 생존효과를 조사 하여 RG-HI의 항돌연변이원성의 기작을 이해하고자 하였다.
- uvrB 또한 “wH와 같이 절제수복 시스템에 관련된 유전자임을 알 수 있었으며, uvrA 의존성 절제수복은 uvrA 단백질과 uvrB, C의 산물이 결합될 경우 활성화된다는 Kenyon과 Walker(16)의 연구결과를 뒷받침하는 실험결과로 해석될 수 있다. 이와 같은 결과들은 변이원에 대한 변이균 주들의 돌연변이 유도가 정확하게 유도된 결과로써 세포 내 항돌연변이 기작을 연구하기 위한 세균계 시스템이 구축된 것으로 사료되었다.
제안 방법
- W(45℃) 670 mL] 20 mL, glucose 4 g per liter) 상에 주입 도포하였다. 37℃에서 48시간 배양하여 이때 생성된 콜로니(trp* revenants) 수를 계수하여 항돌연변이원성을 판정하였다. 항돌연변이원성은 [(M-Si/M-So) X 10이으로 계산 하였고 돌연변이 물질만 존재한 경우의 복귀 돌연변이 수는 M, 자연복귀 돌연변이 수는 So, 돌연변이원과 시료를 첨가 하였을 경우의 복귀 돌연변이 수는 Sr로 나타내었다.
- Rec-lex test에서 RG-in의 작용 시험은 2차 배양전에 배양액 1 mL당 200 mg 농도의 RG-ffl 분획물 50 μL을 5 mL의 본 배양에 첨가하여 0-galactosidase 활성을 비교 분석하였다. 8 -galactosidase 활성 비율은 [양성대조구의 B-gal(units) /시료를 첨가하였을 때 Mgal(units)]으로 계산하였다.
- Nunoshiba와 Nishioka(7)의 방법을 보완하여 수행하였으며 Qgalactosidase를 정량하여 분석하였다. E.
- Rec-lex test에서 RG-in의 작용 시험은 2차 배양전에 배양액 1 mL당 200 mg 농도의 RG-ffl 분획물 50 μL을 5 mL의 본 배양에 첨가하여 0-galactosidase 활성을 비교 분석하였다. 8 -galactosidase 활성 비율은 [양성대조구의 B-gal(units) /시료를 첨가하였을 때 Mgal(units)]으로 계산하였다.
- SOS Chromotest에서 RG-HI의 세포 내 항돌연변이 효과에 관한 수복 기작을 해명하기 위하여 DNA 수복의 경로가 다른 여러 변이주를 사용하여 4NQO와 MNNG에 대한 세포 내 항돌연변이원성과 치사에 대한 생존효과를 조사하였다. SOS 수복은 손상된 세포가 생존하기 위해서 긴급 수복하는 오류 경향 수복계이므로(17) SOS 수복이 차단되면 생존균수는 감 소할 것이다.
- RG-HI는 RecA 단백질의 합성을 증폭시키거나 LexA 산물의 분해를 저해하지 않았으므로 SOS 두 기능의 발현에 영향을 미치지 못했다. 따라서 DNA 수복의 경로가 다른 E. coli B/r 변이주 를 사용하여 4NQO와 MNNG에 대한 세포 내 항돌연변이원성 과 생존효과를 조사하였다. ZA159(»vrB, cM)를 제외한 WP2, WP2s, WP67, CM561, CM6U에서 RG-HI는 4NQO에 대한 생존력을 미약하게나마 증가시켰으나, 이러한 생존력 재활성을 수복모드에 의해 설명할 수는 없었다.
- 저자들은 SOS Chromotest에서 RG-Ⅲ는 RecA 효소의 활성을 억제하거나 LexA repressor 분해할 가능성을 제기한 바 있다(1). 따라서 SOS 반응에 대한 RG-HI의 기작을 자세히 연구하고자 E. coli GW series를 사용하여 Qgalactosidase 활 성을 조사하였다. 먼저 heat shock에 따른 -galactosidase kinetics를 분석하고자 42 ℃ 에서 30분 간격으로 >9-galactosidase 의 활성을 측정하였으며 그 결과는 Figure 1과 같다.
- 변이원의 농도에 따른 치사조건 시험은 1~20%의 생존을 나타내는 변이원의 농도를 설정하기 위하여 시행하였다. 즉4.
- 37℃에서 24시간 배양하여 이때 생성된 콜로니의 수를 계수하였다. 생존력 증가 시험 은 변이원의 농도에 따른 생존 시험 과정과 동일하게 시행하 였으나, 1~20% 생존을 나타내는 농도의 변이원을 처리하였다. 단 4NQO에 대한 치사력이 강한 WP2의 경우는 20% 이상의 생존율을 나타내는 농도에서 시험하였다.
- 숙지황 물추출물로부터 분리된 fractionlH(RG-ni)의 항돌연 변이원성의 기작을 E coli GW, B/r 균주를 이용하여 조사하였다. SOS 유도를 반영하는 -galactosidase 활성이 E.
- 2 50 mL per liter) 상에 주입 도포하였다. 37℃에서 24시간 배양하여 이때 생성된 콜로니의 수를 계수하였다. 생존력 증가 시험 은 변이원의 농도에 따른 생존 시험 과정과 동일하게 시행하 였으나, 1~20% 생존을 나타내는 농도의 변이원을 처리하였다.
- 항돌연변이원성 시험 및 생존력 시험은 Ohta 등의 방법(5) 을 이용하였으며, 먼저 농도에 따른 변이원의 용량반응과 치 사조건 시험을 선행하여 변이원의 유도특성과 최적농도를 설 정하였다. 항돌연변이원성 시험은 L-tryptophan (L-tryptophan 5 mg per top agar 50 mL) 이 함유된 2 mL의 top agar(agar 6 g, NaCl 5 g per litre, 45℃)에 변이원이 처리된 후 세척된 균 현탁액 200 와 300 陽/mL 농도의 시료액 50 를 혼 합하여 3초간 진탕 교반한 다음 Vogel-Bonner medium (VBM; agar 15 g, 50XVB salt[MgSO, .
대상 데이터
- E. coli B/r 및 E. coli GW는 Akanuma 박사(잔류농약연구 소, Japan)와 Bagg 박사(Cambrige 대학, U.S.A)로부터 기증 받았으며 각 균주의 유전자 특성은 Table 1과 같다.
- 본 실험에 사용한 숙지황은 전북 익산시 소재 유한의원에서 기증 받아 사용하였으며 4-nitroquinoline-oxide(4NQO), N-methy 1-N-nitro-N'-nitrosoguan idine( MN NG) 는 Fluca(Switzerland) 회사로 부터 구입하였다.
이론/모형
- 분쇄된 숙지황 시료에 10배(w/v) 량의 증류수를 가하여 수 욕상에서 환류 냉각하면서 2회 추출한 후 여과 및 동결건조 하여 물추출물로 사용하였다. RG-m의 분획은 Ahn 등의 방 법(1)으로 제조하였다.
- coli GW 1105, 1107은 30℃ 에서 210 rpm으로 120분간 연속 배양하였다. 배 양종료 후 0 -galactosidase 측정은 Miller의 방법(8)으로 측정 하였으며 효소활성은 다음 식에 대입하여 계산하였다.
성능/효과
- WP2, WP2s, WP67, CM561, CM611 어】서, RG-HI는 MNNG로 유도된 돌연 변이원성과 치사력을 증가시킴에도 불구하고 ZA159("w8, 에서는 감소시켰다. 4NQO에 대한 세포 내 항돌연변이원성 과 세포외 항돌연변이원성을 비교하였을 때 시험한 E. coli B/r 균주에서 4NQO의 변이원성을 두드러지게 억제하였으나 ZA159(“wB, 商)에서는 상승효과가 상대적으로 감소되었다. 이러한 결과들은 RG-田가 4NQ。의 변이원성을 방어하는 차 단제임을 시사하며, chi 산물의 기능과 유사한 작용을 하는 것으로 사료된다.
- 4NQO와 300 您/mL 농도의 RG-DI를 동시에 처리한 경우, 시험한 모든 균주에서 세포외 항돌연변이는 뚜렷하게 증가되 었으며, 특히 고농도(80 您/mL) 의 4NQO로 유도된 WP2 에서 57%의 세포외 항돌연변이원성을 나타내었다(Table 5). 동일한 농도(2 户g/mL)의 4NQO에 의해 유도된 변이원성에 대하여 ZA159는 WP2s, WP67보다 낮은 억제활성(Table 5)을 보 였는데, 이는 세포밖에서도 chi 유전자 산물이 RG-m의 돌연 변이 억제효과에 영향을 미치는 것으로 해석된다.
- 먼저 heat shock에 따른 -galactosidase kinetics를 분석하고자 42 ℃ 에서 30분 간격으로 >9-galactosidase 의 활성을 측정하였으며 그 결과는 Figure 1과 같다. GW1060 및 1103에서 효소활성의 최적시간은 60분으로 평가되었고, 120분에서는 각각 37.1, 17.7%의 감소율을 나타내었다. GW1103 (“»i“C::Mud)에 비해 GW1060 ("〃l::Mud)에서 SOS 반응이 고발현한 결과는 SOS 반응이 유도되지 않아도 절제 수복은 발현되며 umuc 의존성 SOS 수복은 긴급한 상황에서 만 유도됨을 시사하고 있다.
- GW1103 (“»i“C::Mud)에 비해 GW1060 ("〃l::Mud)에서 SOS 반응이 고발현한 결과는 SOS 반응이 유도되지 않아도 절제 수복은 발현되며 umuc 의존성 SOS 수복은 긴급한 상황에서 만 유도됨을 시사하고 있다. GW1107(»M)은 SOS 반응의 repressor인 lexA 유전자가 결실된 균주로 30℃에서 2시간 동안 배양한 결과 예상대로 SOS 반응이 항구적으로 유도됨을 알 수 있었다(Table 2).
- 또한 GW1105에서도 아무런 영향을 미치지 못하였으므로 LexA 단백질이 분해되는 과정 에도 관여하지 않음을 알 수 있었다. 결론적으로 RG-HI는 SOS 두 가지 기능의 발현을 차단하지 못하였으므로 SOS Chromotest에서 RG-H1 의 세포 내 항돌연변이 활성은 세포내에서 DNA의 손상을 차단하거나 수복을 돕는 과정에 작용했을 것으로 해석된다.
- 4NQO와 300 您/mL 농도의 RG-DI를 동시에 처리한 경우, 시험한 모든 균주에서 세포외 항돌연변이는 뚜렷하게 증가되 었으며, 특히 고농도(80 您/mL) 의 4NQO로 유도된 WP2 에서 57%의 세포외 항돌연변이원성을 나타내었다(Table 5). 동일한 농도(2 户g/mL)의 4NQO에 의해 유도된 변이원성에 대하여 ZA159는 WP2s, WP67보다 낮은 억제활성(Table 5)을 보 였는데, 이는 세포밖에서도 chi 유전자 산물이 RG-m의 돌연 변이 억제효과에 영향을 미치는 것으로 해석된다. 160 pg/mL 의 농도의 4NQO를 처리한 경우 WP2의 치사율이 약간 감소 하였으나(Table 4), 300 pg/mL 농도의 RG-田와 80 μg/mL 농 도의 4NQO를 동시에 처리한 경우 57%의 세포외 항돌연변 이 효과를 나타내었다.
- 그러나 RG-m를 첨가하였을 경우에 4NQO로 처리된 균주들의 생육은 미미하게 증가되었다(Table 4). 따라서 RG-HI의 항돌연변이원성은 SOS 수복 저해효과에 기인된 결과가 아님을 재확인할 수 있었다. 4NQO를 처리한 후 top agar에 300 阐mL 농도의 RG-HI를 첨가하였을 경우, WP2 (DNA repair profient strain)는 13%의 세포 내 항돌연변이 효과를 나타낸 반면 WP2s(wvM), WP67(«vM, polA), ZA159 (uvrB, c/讥에서는 세포 내 항돌연변이원성이 나타나지 않았다.
- polA 유전자는 DNA polymerase I 의 합성을 조절하며 single strand gap을 연결시키는 기능을 갖는다(12). 따라서 poM가 결실된 균주는 알킬화로 인해 생성된 single strand break을 연결할 수 없기 때문에 MNNG에 의해 유도되는 돌연변이 수가 크게 감소된 반면, uvrA 이외의 uvrB, C 유전자에 의해 절제된 후 DNA polymerase I 에 의해 single strand gap이 연결될 수 있는 WP2s에서는 돌연변이 수가 증가된 것으로 확인되었다. lexA 결실 균주인 CM561, 611의 경우, LecA102가 RecA에 의해 분해되지 않으므로 SOS 반응이 유도되지 않는다(13).
- RG-HI에 의해 GW1107의 효소활 성이 저해되지 않는 것은 SOS반응의 억제제인 LexA의 작용 에 관여하지 않음을 시사한다. 또한 GW1105에서도 아무런 영향을 미치지 못하였으므로 LexA 단백질이 분해되는 과정 에도 관여하지 않음을 알 수 있었다. 결론적으로 RG-HI는 SOS 두 가지 기능의 발현을 차단하지 못하였으므로 SOS Chromotest에서 RG-H1 의 세포 내 항돌연변이 활성은 세포내에서 DNA의 손상을 차단하거나 수복을 돕는 과정에 작용했을 것으로 해석된다.
- 모든 결과를 종합해 볼 때 RG-HI는 세포 내 . 외에서 4NQO 로부터 발생된 nitrenium ion(5)을 차단하거나 상쇄시키는 효 과로 인해 4NQO의 치사력에 대해 생존력을 미약하게 증가 시켰으며, chi 유전자 산물(nitrate reductase, formate dehydrogenase, biotin sulfoxide reductase, molybdenum-containing factor)(19)과 유사한 작용을 나타내는 것으로 사료된다
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