[논문]Brevibacterium lactofermentum의 dapD 유전자의 Cloning 및 E. coli에서의 발현

김옥미; 박선희; 박혜경; 이승언; 하대중; 이갑랑

문제 정의

그러므로 본 연구자 등은 B.lactofermentum의 lysine 생 산성에 있어 succinylase 경로 및 dehydieogenase 경로의 상 봔 관계를 좀 더 면밀히 조사하기 위해서 succinylase 경로를 차단시 켜 dehydrogenase 경로의 단독작용을 조사하기로 하 였다, 그런데 지 금까지 B.lactofermentum의 succinyl日도巳 경로 에 관여 하는 dapD, dapE, dapC 및 dapF 유전자의 분리 가 보고된 바는 없다.
따라서 본 연구에서는 B.lactofermentum의 succinylase 겅 로에 관여 하는 유전지-, 즉 lysine 생합성 단계의 중간 물질 인 THDPA로耳-e] N-succinyl-L-2-amino-6-ketopimelate 로 전환시 켜 궁극적으로 lysine을 생 합성 하는 dapD 유전자 를 complementation test를 통하여 cloning하고, E coli에서의 발현을 조사하였다.

가설 설정

2)ND, not detected.

제안 방법

B. lactofermentum dapD 유전자의 E. coli에서의 발현을 확인하기 위하여 재조합 plasmid pLSl 및 pLS2를 dapD가 결여된 丘 coli AT986으로 형질전환시켜 균체 성상 및 Llysir比을 정량하였다. Table 2에서 보는 것처럼 대조균주로 사용한 R call AT986은 M9 선택배지 에서 성장하지 못하였 으며 dapD 유전자를 함유한 균주의 성장은 wild type으로 사용한 E.
B. lactofermentum 의 genomic library로부터 dapD 유전자를 cloning 하기 위하여 genomic library DNA를 dapD가 결 여 된 E. coli AT986 내로 형 질 전환 시 킨 결괴-, DAP가 함유되지 않꼬 ampicillin 및 thiamine이 첨가된 M9 선택배지에서 72시간 만에 성장하는 20개의 Ap「, DAP1' 형질전환체를 획득했다. 선별된 형질전환체들을 M9 선택배지에서 성장하였으 므로 영양요구성이 해제되었음을 알 수 있었지만 이들 형질전환체 중에는 dapD 유전자 외에도 ddh 유전자가 함유될 수 있기 때문에 20개의 형질전환체 중에서 5개의 형질전환체를 선별하여 DDH 효소 활성을 측정하였다.
균체 농도는 채취 한 배 양액을 적 당한 비율로 희석 하여 분광광도계 (U-200。, Hitachi Co., Japan)를 사용하여 600 nm에서 홉 광도를 측정하였으며, lysine 정량은 배양된 균체의 세 포를 sonicator으로 파괴한 후 원심 분리한 상등액을 crude extract로 사용하여 OD如5에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
그 결과 1개의 형질전환체가 DDH 효소 활성을 나타내고 나머지 형질전환체에서 는 활성이 검출되지 않았다(data not shown). 그러므로 1개의 형질전환체는 ddh 유전자를 함유하고 있다고 판단되어 제외시키고 나머지 4개의 형질전환체로부터 plasmid DNA를 분리한 후 제한효소 BwnHI으로 절단 시켜 전기영동 하였다. Fig.
lactofermentum으로부터 유래하였으며 염색체 DNA내에 single copy로 존재함을 알 수 있었다. 또한 lysine 생성 량 분석을 통하여 E. co/i에서 B. lactofermentum dapD 유전자의 발현을 확인하였다.
산업 적으로 lysine 발효 산업 에 이용되고 있는 B. lactofer mentum으로부터 Jysine 생합성 에 관여하는 tetrahymdipico-linate N-succinyl transferase를 지 령 하는 dapD 유전자를 E. 의 dapD 결손변이주와의 complementation test를 통하여 cloning하였다. 재조합 plain记는 3.
coli AT986 내로 형 질 전환 시 킨 결괴-, DAP가 함유되지 않꼬 ampicillin 및 thiamine이 첨가된 M9 선택배지에서 72시간 만에 성장하는 20개의 Ap「, DAP1' 형질전환체를 획득했다. 선별된 형질전환체들을 M9 선택배지에서 성장하였으 므로 영양요구성이 해제되었음을 알 수 있었지만 이들 형질전환체 중에는 dapD 유전자 외에도 ddh 유전자가 함유될 수 있기 때문에 20개의 형질전환체 중에서 5개의 형질전환체를 선별하여 DDH 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 1개의 형질전환체가 DDH 효소 활성을 나타내고 나머지 형질전환체에서 는 활성이 검출되지 않았다(data not shown).
실험에 사용한 모든 균주 배양에는 LB(LuHa-Bertani) 배 지 (1) )를 사용하였으며, 필요에 따라 ampicillin(50 Ug/mL)을 첨가하여 배양하였匸h M9 선택배지(11)는 dapD 유전자를 cloning 하기 위한 최소배지로 사용하였으며, 필요에 따라 thiamine(O.lM), DAP(50 μg/mL) 및 ampicillin(50 jig/mL)을 첨가하여 사용하였다. E.

대상 데이터

lactofermentum KTCC1844(10)의 genomic library는 본 연구실에서 보유한 것을 사용하였다. E. coli AT986은 dapD 유전자를 cloning 하기 위한 host로, E. coli JM109는 plasmid DNA를 안정하게 보관 시 키기 위한 균주로 사용하였다. Plasmid pBR322는 B.
제한효소 BamH I으로 부분 절단된 B. lactqfermentum 의 염색체 DNA와 역시 동일 효소로 절단된 pBR322 DNA를 ligation 시켜 제조된 B. lactofermentum KTCC1844(10)의 genomic library는 본 연구실에서 보유한 것을 사용하였다. E.

이론/모형

DDH 활성 측정은 Roh 등(8)으] 방법에 따라 행하였으며 lysine 정량은 chinard의 방법 (14) 에 따라 항생제가 첨가된 LB 배지에서 배양시킨 균체를 원심분리하여 모우고 0.9% NaCl 용액으로 2회 세척한 다음, 각 sample의 ODeoo 값을 동일하게 하여 M9 선택배지로 채 접종하여 37℃에서 72시간 배양하였다.
E. coli로부터 plasmid DNA 분리는 Birnboim and Doly의 alkaline lysis 방법 (12) 에 따라 추출되었다. 제한효소 및 ligation 반응은 Sam brookk 등의 방법(11)에 준하여 수행하였으며 DNA 단편은 투석막을 이용하여 agarose gel 상에서 분리되었다.
제한효소 및 ligation 반응은 Sam brookk 등의 방법(11)에 준하여 수행하였으며 DNA 단편은 투석막을 이용하여 agarose gel 상에서 분리되었다. E. coli의 형질전환은 Sambrook 등(11)의 방법에 따라 행하였으며, DAP ', Apr 형질전환 체 들은 DAP가 함유되지 않고 ampicillin 및 thiamine이 첨가된 M9 선택배지에서 선별되었다.
Southern hybridizatione Southern의 방법 (13) 에 따라 수행하였으며 이때 probe DNA는 dapD를 함유한 DNA 단편을 [a-32p]dATP로 labeling 하여 사용하였다.
coli로부터 plasmid DNA 분리는 Birnboim and Doly의 alkaline lysis 방법 (12) 에 따라 추출되었다. 제한효소 및 ligation 반응은 Sam brookk 등의 방법(11)에 준하여 수행하였으며 DNA 단편은 투석막을 이용하여 agarose gel 상에서 분리되었다. E.

성능/효과

dapD 유전자를 함유한 DNA 단편의 제한 지도 작성을 위해 pLSl로부터 3.6 kb의 BamHI단편을 분리하여 multicloning §ite를 함유하고 있는 pBluescriptn SK*의 BaniHL site에 삽입하여 pLS2를 제조하였다, pLS2를 여러 종류의 제한효소로 절단 시 켜 확인한 결과 dapD 유전자를 포함한 DNA 단편 내에는 Xhol site가 1개, Pstl 및 Hmdin 诳坨가 각각 2개씩 존재하였다(Fig. 4).
선별된 형질전환체들을 M9 선택배지에서 성장하였으 므로 영양요구성이 해제되었음을 알 수 있었지만 이들 형질전환체 중에는 dapD 유전자 외에도 ddh 유전자가 함유될 수 있기 때문에 20개의 형질전환체 중에서 5개의 형질전환체를 선별하여 DDH 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 1개의 형질전환체가 DDH 효소 활성을 나타내고 나머지 형질전환체에서 는 활성이 검출되지 않았다(data not shown). 그러므로 1개의 형질전환체는 ddh 유전자를 함유하고 있다고 판단되어 제외시키고 나머지 4개의 형질전환체로부터 plasmid DNA를 분리한 후 제한효소 BwnHI으로 절단 시켜 전기영동 하였다.
의 dapD 결손변이주와의 complementation test를 통하여 cloning하였다. 재조합 plain记는 3.6 kb의 DNA 단편을 함 유하고 있었으며 Southern blot hybridizatione 통하여 dapD 유전자는 B. lactofermentum으로부터 유래하였으며 염색체 DNA내에 single copy로 존재함을 알 수 있었다. 또한 lysine 생성 량 분석을 통하여 E.

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