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문제 정의
- 이 에 본 연구는 구기자의 간 보호 효능을 검 토하는 일환으로 구기자를 알콜 추출 후 용매를 휘 발시 킨 뒤 분말로 하여일반식이에 첨가시킨 사료로 1개월간 성장시킨 횐쥐를 처치하여 유해산소 및 알콜대사 효소활성 을 측정 하여 상호비교함으로서 구기자의 해독작용을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 간의 difference spectrmm을 그렸다. 450 — 490 nm 에서 흡광도의 차이를 CYP CO complex에 의 한 흡광량으로 하고 CYP CO complex의 분자흡광계수( s =91를 이용하여 CYF의 양을 계산하였다. Microsome의 CYP 양은 단백질 1 mg당 nmole로 표시하였다一
- 한편 mitochondria 분획 을 제 거 시 킨 상징 액 을 105, 000 x g에서 1 시 간 동안 초원 심 분리 하여 cytosol 분획 과 microsome 분획을 분리 하였다. Cytosol 분획은 xanthine oxidase(XO), glu- tathione peroxidase(GPx), glutathione-S-transferase(GST), superoxide dismutase(SOD), alcohol dehydrogenase(ADH) 및 aldehyde dehydrogenase(ALDH) 활성 측정 에 사용하였으며, mitochondria 분획은 catalase(CAT) 활성 측정 에, mi crosome 분획 은 cytochrome P-450(CYP) 함량 및 glucose- 6-phosphatase(G6Pase) 활성 측정 에 사용하였다. 한편 채취한 혈액은 응고시킨 다음 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻고 alanine aminotransferase (ALT) 활성 측정용 시료로 사용하였다.
- 하였다. 구기자 사료를 믹서로 분말상태로 한 후 1 kg을 취하여 30% 에탄올 3 L를 가하여 환류냉각장치를 이용하여 30°C에서 72 시간 추출한 후 감압농축하여 부피를 감소시킨 후 냉동 건조한 고형 물(이 하 에 탄올 추출물, LCEE)을 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 구기자 추출물 첨가식이로 성장한 흰쥐의 간에 있어서 AL DH 활성이 높게 나타나는 원 인을 규명코자 acetaldehyde 농도를 변경 시 키면서 간조직 중 ALDH 활성을 측정 하여 dou ble reciprocal plot로 나타낸 것 이 Fig. 2와 같디-. 구기 자 추출물 첨가식이군 및 대조군 모두 Km 치는 980 mM로서 동일한 값을 나타내 었으니, , Vmax치 는 2% 및 4% 구기 자 식 이 군 모두 대조군보다 각각 71%(660 nmole/), 40%(526 nmoie/mg pro- tein/min)의 증가를 보였다.
- . 동물은 ether 마취 시킨 다음 복부 정중선을 따라 개복한 후 뽁부대동맥으로부터 채혈하여 실혈사시킨 후, 4°C 생리식 염수로 간을 관류시켜 간조직 내에 남아있는 혈액을 제거한 다음 적출하였다.
- 내외의 것을 실험에 사용하였다. 또한 구기자 추출물을 사료 100 g 당 2% 및 4%를 함유시 켜 실험 동물 사료로 사용하여 1개월간 사육하였다. 실험군은 대조군, 2% 구기자 첨가 식이 군(LCEE), 4% 구기자 첨가식 이군(LCEE)으로 나누었다.
- 또한 구기자 추출물을 사료 100 g 당 2% 및 4%를 함유시 켜 실험 동물 사료로 사용하여 1개월간 사육하였다. 실험군은 대조군, 2% 구기자 첨가 식이 군(LCEE), 4% 구기자 첨가식 이군(LCEE)으로 나누었다. 각 실험군은 실험동물 1Q마리를 사용하였다.
- 각 실험군은 실험동물 1Q마리를 사용하였다. 실험동물은 처치 전 24시 간 동안 절식 시 켰으며 동물의 처 치는 효소 활성 의 일 중 변동을 고려하여 일정 시간에 실시할 수 있도록 시간을조절하였디..
- 이 균질액을 600Xg에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄부분을 제거한 상층액을 10, 000X g에서 20분간 원심분리하여 mitochondria 분획을 얻었다. 한편 mitochondria 분획 을 제 거 시 킨 상징 액 을 105, 000 x g에서 1 시 간 동안 초원 심 분리 하여 cytosol 분획 과 microsome 분획을 분리 하였다. Cytosol 분획은 xanthine oxidase(XO), glu- tathione peroxidase(GPx), glutathione-S-transferase(GST), superoxide dismutase(SOD), alcohol dehydrogenase(ADH) 및 aldehyde dehydrogenase(ALDH) 활성 측정 에 사용하였으며, mitochondria 분획은 catalase(CAT) 활성 측정 에, mi crosome 분획 은 cytochrome P-450(CYP) 함량 및 glucose- 6-phosphatase(G6Pase) 활성 측정 에 사용하였다.
- 흰쥐에 있어서 구기자 추출물 첨가식이가 간조직의 유해산소 대사기구와 알콜대사에 어떠한 효과가 있는지를 알아보기 위 하여 구기자 알콜 추출물을 사료에 2%, 4%를 첨 가시 켜 1개월간 사육한 후 처치하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 구기 자 추출물 첨 가식 이 로 성 장하는 동안 체중증가율은 대조군보다 오히려 약간 감소되는 경향을 보였으며 간기능은대조군과 별다른 차이 가 없 었다.
대상 데이터
- 23。 g 내외의 것을 실험에 사용하였다. 또한 구기자 추출물을 사료 100 g 당 2% 및 4%를 함유시 켜 실험 동물 사료로 사용하여 1개월간 사육하였다.
- 실험군은 대조군, 2% 구기자 첨가 식이 군(LCEE), 4% 구기자 첨가식 이군(LCEE)으로 나누었다. 각 실험군은 실험동물 1Q마리를 사용하였다. 실험동물은 처치 전 24시 간 동안 절식 시 켰으며 동물의 처 치는 효소 활성 의 일 중 변동을 고려하여 일정 시간에 실시할 수 있도록 시간을조절하였디.
- 건조된 구기자종자를 처 양군 비봉 농협 에서 구입 하였다. 구기자 사료를 믹서로 분말상태로 한 후 1 kg을 취하여 30% 에탄올 3 L를 가하여 환류냉각장치를 이용하여 30°C에서 72 시간 추출한 후 감압농축하여 부피를 감소시킨 후 냉동 건조한 고형 물(이 하 에 탄올 추출물, LCEE)을 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험 성적의 통계처리는 Student's t-test(17)로 하였으며 유의수준은 0.05 이하로 하였다.
이론/모형
- 활성도 단위는 hematoxylin의 자동산화를 50% 억 제 하는 정 도를 1 unit 로 나타내 었다. CAT 활성 측정 은 Aebi의 방법 (12)에 준하였으며, ADH오卜 ALDH 활성 측정은 Bergmeyer외 방법(13)으로 측정하였디-.
- GSH의 함량은 Ellman의 방법 (15)에 따라 비 단백성 sul fhydryl group을 5, 5, -dithiobis(2-nitrobenzoic acid)로 발색 시켜 412 nm에서 비색 정량하였다. GSH의 함량 단위는 간 조직 1 g당 jimole로 나타내었다一
- XO 활성 측정 은 Stirpe와 Della Corte의 방법 (7), GPx 활성 촉 정은 Paglia와 Valentine의 방법 (8), GST* Habig 등의 방법 (9), 그리고 간조직 중 microsome 분획의 G6Pase 활성도 즉정은 Hasushi 등의 방법 (10)에 준하여 측정하였다. SOD 활성 측정은 hematoxylin 자동산화의 억제정도를 관찰하는 Martin 등의 방법 (11)에 의하여 측정하였으며 hematoxylin 및 효소액을 가해 25°C에서 반응시켜 생성된 hematein을 560 nm에서 측정하여 효소의 활성도를 신-정하였다. 활성도 단위는 hematoxylin의 자동산화를 50% 억 제 하는 정 도를 1 unit 로 나타내 었다.
- XO 활성 측정 은 Stirpe와 Della Corte의 방법 (7), GPx 활성 촉 정은 Paglia와 Valentine의 방법 (8), GST* Habig 등의 방법 (9), 그리고 간조직 중 microsome 분획의 G6Pase 활성도 즉정은 Hasushi 등의 방법 (10)에 준하여 측정하였다. SOD 활성 측정은 hematoxylin 자동산화의 억제정도를 관찰하는 Martin 등의 방법 (11)에 의하여 측정하였으며 hematoxylin 및 효소액을 가해 25°C에서 반응시켜 생성된 hematein을 560 nm에서 측정하여 효소의 활성도를 신-정하였다.
- 단백 질 정 량은 Lowry 등의 방법 (16)에 준하여 bovine se rum albumin을 표준품으로 하여 측정하였다.
- 혈청 중 ALT 활성도 측정은 Reitman과 Frankel의 방법 ⑸에 따라 조제된 kit 시 약(아산저】 약)을 사용하였으며 , 활성도 단위 는 혈청 mL 당 Karmen 단위 (6)로 표시 하였다. XO 활성 측정 은 Stirpe와 Della Corte의 방법 (7), GPx 활성 촉 정은 Paglia와 Valentine의 방법 (8), GST* Habig 등의 방법 (9), 그리고 간조직 중 microsome 분획의 G6Pase 활성도 즉정은 Hasushi 등의 방법 (10)에 준하여 측정하였다.
성능/효과
- 1과 같다. 2% 구기자추출물 첨 가식 이 로 성 장한 실 험 군(2% LCEE) 및 4% 구기 자 추출물 첨가식 이로 성장한 실험군(4% LCEE) 모두 대조군보다 체중증가율이 다소 낮게 나타났으며 통계적 인 유의 성은 없었다. 그리고 4% LCEE군이 2% LCEE군보다 체중증가율이 다소 낮게 나타남을 알 수 있었다.
- 것이 Table 4와 같다. 2% 및 4% 구기자 첨가식이군 모두 간 조직 중 ADH 활성은 대조군에 비하여 약 16% 증가되는경향을 보였다. 특히 ALDH 활성은 2% 구기자 식이군이 대 王군에 비하여 53%의 유의한(pCO.
- 구기 자 추출물 첨 가식 이 로 성 장하는 동안 체중증가율은 대조군보다 오히려 약간 감소되는 경향을 보였으며 간기능은대조군과 별다른 차이 가 없 었다. 간조직 의 xanthine oxidase 활성은 구기자 첨가식이군과 대조군 간에는 별다른 차이를 볼 수 없 었으며 cytochrome P450 함량은 2% 및 4% 구기자추출물 첨 가식 이군이 대조군보다 높게 나타나는 경 향을 보였다. 그리고 간조직의 catalase 활성은 2% 및 4% 구기자추출물 첨가식이군 모두 대조군보다 유의한(p<0.
- 얻었다. 구기 자 추출물 첨 가식 이 로 성 장하는 동안 체중증가율은 대조군보다 오히려 약간 감소되는 경향을 보였으며 간기능은대조군과 별다른 차이 가 없 었다. 간조직 의 xanthine oxidase 활성은 구기자 첨가식이군과 대조군 간에는 별다른 차이를 볼 수 없 었으며 cytochrome P450 함량은 2% 및 4% 구기자추출물 첨 가식 이군이 대조군보다 높게 나타나는 경 향을 보였다.
- 2와 같디-. 구기 자 추출물 첨가식이군 및 대조군 모두 Km 치는 980 mM로서 동일한 값을 나타내 었으니, , Vmax치 는 2% 및 4% 구기 자 식 이 군 모두 대조군보다 각각 71%(660 nmole/), 40%(526 nmoie/mg pro- tein/min)의 증가를 보였다.
- OOl) 증가를 보였다. 그■ 리고 구기자 추출물 첨가식이군과 대조군의 Km치는 980 mM로 동일한 값을 나타내었으나, Vmax치는 2% 및 4% 구기자 추출물 첨가식이군이 대조군보다 각각 71%(660 nmole) 및 40%(526nmole)로 증가하였다一 이상 실험결과는 식이 중구 기자 알콜 추출물 첨가는 유해산소 및 알콜의 해독 효과를 나타냄을 시사해 주고 있.다.
- 그러나 구기자 추출물 첨가식이로 실험동물을 성장시킬 겅우 체중증가율은 대조군에 비하여 다소 떨어지는 경향을 보여줌을알 수 있었다.
- 2% 구기자추출물 첨 가식 이 로 성 장한 실 험 군(2% LCEE) 및 4% 구기 자 추출물 첨가식 이로 성장한 실험군(4% LCEE) 모두 대조군보다 체중증가율이 다소 낮게 나타났으며 통계적 인 유의 성은 없었다. 그리고 4% LCEE군이 2% LCEE군보다 체중증가율이 다소 낮게 나타남을 알 수 있었다. 한편, 체중 당 간무게, 간조직 중 단백질 함량, 혈청 ALT 활성 과 간손상시 활성 이감소된다는 간조직 중 glucose-6-phosphatase 활성(10)은 구기자 첨가식이로 성장시킨 실험군과 대조군간에는 별다른 차이를 볼 수 없었다(Table 1).
- 간조직 의 xanthine oxidase 활성은 구기자 첨가식이군과 대조군 간에는 별다른 차이를 볼 수 없 었으며 cytochrome P450 함량은 2% 및 4% 구기자추출물 첨 가식 이군이 대조군보다 높게 나타나는 경 향을 보였다. 그리고 간조직의 catalase 활성은 2% 및 4% 구기자추출물 첨가식이군 모두 대조군보다 유의한(p<0.05) 증가를보였으나 두 실험군 간에는 별다른 차이를 볼 수 없었다. 또한 superoxide dismutase 활성 은 2% 구기 자 추출물 첨 가식 이 군이 대조군보다 유의한(p<0.
- 05) 증가를보였으나 두 실험군 간에는 별다른 차이를 볼 수 없었다. 또한 superoxide dismutase 활성 은 2% 구기 자 추출물 첨 가식 이 군이 대조군보다 유의한(p<0.05) 증가를 보였으며, 4% 구기자 추출물 첨가식이군은 대조군과는 별다른 차이가 없었으나 2% 구기자 추출물 첨가식이군에 비해서는 다소 감소하는 경향을 보였다. 그버나 glutathione 함량, glutathione-S- transferase 활성은 구기자 추출물 첨가식 이군과 대조군 간에는 별다른 차이를 볼 수 없었다.
- 본 실 험 결 과에 서 는 구기 자 2%, 4% 함유시 킨 식 이 로 성 장 시킨 흰쥐에 있어서 XO 활성이 대조군과 별다른 차이를 볼 수 없 었으며 , 간조직 중 microsomal CYP 함량은 2%, 4%의 吁기자를 함유시 킨 실험 군에 있어 서 각각 29%, 21% 증가되었으며 유의성은 없었다(Table 2).
- 이상 실험결과를 보아서 구기자가 유해산소 생성 에는 별다른 관련 성 이 없으리 라 생 각되 며, microsomal CYP 함량이 유도되는 경향을 보아서 독성몰질대사에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- 이상 실험결과를 종합헤 볼 때 구기자는 유해산소 해독에꽌여함을 시사해주고 있으며 이는 구기자가 SOD, catalase 활성을 유도함으로 나타난 결과로 생각된다.
- 2% 및 4% 구기자 첨가식이군 모두 간 조직 중 ADH 활성은 대조군에 비하여 약 16% 증가되는경향을 보였다. 특히 ALDH 활성은 2% 구기자 식이군이 대 王군에 비하여 53%의 유의한(pCO.OOI) 증가를 보였으며, 4% 구기자 식이군 역시 대조군에 비하여 약 36%의 유의한 (p<0.01) 증가를 보였다.
- 그버나 glutathione 함량, glutathione-S- transferase 활성은 구기자 추출물 첨가식 이군과 대조군 간에는 별다른 차이를 볼 수 없었다. 한편 간조직의 alcohol dehydrogenase 활성은 2% 및 4% 구기자 추출물 첨가식 이 군이 대조군보다 높게 나타나는 경 향을 보였으며 , 특히 alde hyde dehydrogenase 활성 은 2% 및 4% 구기 자 추출물 첨 가식이군 모두 대조군보다 유의한(pCO.OOl) 증가를 보였다. 그■ 리고 구기자 추출물 첨가식이군과 대조군의 Km치는 980 mM로 동일한 값을 나타내었으나, Vmax치는 2% 및 4% 구기자 추출물 첨가식이군이 대조군보다 각각 71%(660 nmole) 및 40%(526nmole)로 증가하였다一 이상 실험결과는 식이 중구 기자 알콜 추출물 첨가는 유해산소 및 알콜의 해독 효과를 나타냄을 시사해 주고 있.
후속연구
- 늠Y게 나타날 것으로 생각되지만 이 점에 대해서는 추후 연구 검도 되어야 할 과제로 남아 있다.
- 이상 실험결과를 총합해 볼 때 식이 중 구기자 성분은 알콜 해독에 효능이 있을 것으로 생각되며 이는 구기자 성분이알콜 해독에 관여 하는 aldehyde dehydrogenase(ALDH) 효소 단백합성이 유도된 것으로 추정되나 이에 대하여 확인할 필요가 있다31 생각되며 이후 연구할 과제로 남아있다.
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