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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 구기자 생체시료와 세포 배양한 캘러스의 한방적 효능을 비교 조사하기 위하여 구기자 생체시료와 세포배양한 캘러스를 사염화탄소로 유발된 간장해 흰쥐에 각각 투여하여 GOT 및 GPT의 활성에 대한 효과를 조사하였다.
- 이에 본 연구에서는 사염화탄소로 유발된 간 손상 흰쥐를 이용하여 간독성 보호효과를 보기 위하여 구기자와 대량 증식된 배양세포로부터 각각 추출한 열수 추출물이 간장해 유발 흰쥐에서 GOT 및 GPT 활성에 미치는 효과를 비교 분석하고자 하였다.
제안 방법
- 표면 살균된 종자는 생장조절 물질을 함유하지 않은 MS배지9)에 치상하여 25±1 ℃의 암소에서 발아시켰다. 발아된 유묘는 25土℃, 3, 000 lux 형광하에서 16시간의 광주기와 8시간의 암주기 조건으로 3/2 MS배지"*)에 치상하여 증식을 도모하였으며, 성장한 줄기는 동일 배지에 삽목방식으로 무균 증식시켰다.
- 24시간 동안 절식시킨 5일째 검체와 silymarin을 다시 투여하였으며, 2시간이 경과한 후 olive oil에 사염화탄소를 현탁한 다음 5% (v/v)의 사염화탄소를 5 ㎖/kg (1 ml/200 g)씩 경구 투여한 다음 계속 절식을 시켰다.
- 75% agar가 함유된 3/2 MS 배지에 접하도록 치상하여 25±rc 정온하의 암처에서 배양하였다. 3주 후 잎표면에 유기된 캘러스 중 유연한 캘러스만을 선발하여 캘러스 유기시와 같은 배지에 옮겨 주었으며, 3주 간격으로 계대배양 하면서 캘러스 증식을 도모하였다.
- 경북 임업시험장 포장에 식재된 5년생 구기자(Lycium chinense Mill.)의 종자를 채취하여 70% (v/v) 에탄올에 1분 3% (v/v) 차아 염소산 나트륨에 1분, 3% (v/v) 과산화소수에 3분간 표면 살균한 후 이것을 멸균수로 3회 수세하였다. 표면 살균된 종자는 생장조절 물질을 함유하지 않은 MS배지9)에 치상하여 25±1 ℃의 암소에서 발아시켰다.
- 구기자 캘러스 추출물의 간독성에 대한 효과를 보기 위하여 사염화탄소 유발 간장해 모델에 대하여 캘러스 추출물을 0.5 g/kg용량으로 4일간 1일 1 회 투여하였다. 그리고 24시간 절식시킨 5일째 다시 0.
- 구기자 혼합 생체시료의 COT 및 GPT 활성의 억제 효과를 알아보기 위하여 체중 200 g 내외의 SD계 mt를 사용하여 구기자 혼합 생체시료는 0.5 g/kg 그리고 0.5% CMC (carboxy methyl cellulose) 용액에 현탁한 silymarine 100 ㎎/㎏ 용량으로 1일 1회로 4일간 경구 투여하였다.
- 5 g/kg용량으로 4일간 1일 1 회 투여하였다. 그리고 24시간 절식시킨 5일째 다시 0.5g&g을 경구 투여하였다.
- 그리고 구기자 생체시료 추출물의 간독성에 대한 효과를 보기 위하여 사염화탄소에 의해 유발된 간장해 모델에 대하여 추출물을 0.5 g/kg용량으로 4일간 1일 1회 투여하였으며, 24시간 절식시킨 5일째 다시 0.5 g/kg을 경구 투여하였다. 2시간이 경과한후 CCZ를 투여한 결과, 혈청 중 GOT의 활성도는 대조군 949 Karmen unit 에 대하여 검체군은 760.
- 에테르로 마취시켰다. 마취된 rat의 복부대동맥으로부터 체혈을 실시하였으며, 체혈된 혈액은 곧바로 3, 000 rpm에서 2분간 원심분리하여 혈청을 얻었다.
- 사염화탄소 경구 투여 24시간이 경과하였을 때 rat를 에테르로 마취시켰다. 마취된 rat의 복부대동맥으로부터 체혈을 실시하였으며, 체혈된 혈액은 곧바로 3, 000 rpm에서 2분간 원심분리하여 혈청을 얻었다.
- g에 가까운 개체를 선발하였다. 선발한 동물들은 무작위 법을 이용하여 군분리를 실시하였으며, 동물의 개체 식별은 사육 상자별 tag표시법을 사용하였다 흰쥐 7마리를 1군으로 하여 사염화탄소 비투여 정상군 (normal), 사염화탄소 투여 대조군 (control), 검체와 사염화탄소 투여 실험군 (mixture와 callus), 양성대조군인 비교약물 silymarin 투여군으로 나누었다.
- 캘러스의 유기는 Park 등의 방법에 따라 완전히 전개된 잎을 수거하여 소독된 침으로 자극한 후, 잎 후면이 0.001 ~0.1 |1M의 BA, 0.01-10 μM의 2, 4-D, 3% sucrose 그리고 0.75% agar가 함유된 3/2 MS 배지에 접하도록 치상하여 25±rc 정온하의 암처에서 배양하였다. 3주 후 잎표면에 유기된 캘러스 중 유연한 캘러스만을 선발하여 캘러스 유기시와 같은 배지에 옮겨 주었으며, 3주 간격으로 계대배양 하면서 캘러스 증식을 도모하였다.
대상 데이터
- (주)대한 실험동물 센터로부터 SD (Sprague-Dawley) 계 웅성 rat (SPF, 특정 병원균 부제 동물)를 구입하였다. 온도 23±1℃, 습도 55±5%, 조도 300 -500 Lux, 명암 주기 12시간, 배기 10~18회/hr의 사육환경이 유지된 폴리카보네이트 사육 케이지에 4마리씩 넣어 사육하였다.
- 2주간의 순화기간 중에서 건강하다고 판정된 동물들만을 선별한 후, 체중을 측정하여 평균 체중이 200 g에 가까운 개체를 선발하였다. 선발한 동물들은 무작위 법을 이용하여 군분리를 실시하였으며, 동물의 개체 식별은 사육 상자별 tag표시법을 사용하였다 흰쥐 7마리를 1군으로 하여 사염화탄소 비투여 정상군 (normal), 사염화탄소 투여 대조군 (control), 검체와 사염화탄소 투여 실험군 (mixture와 callus), 양성대조군인 비교약물 silymarin 투여군으로 나누었다.
- 검체는 자연산 구기자의 혼합 생체시료 (열매, 잎뿌리 = 1 : 1 : 1)와 조직배양을 통하여 얻은 구기자 캘러스를 증류수로 2회 3시간 동안 가열 추출 한점 조성 추출물을 사용하였으며, 이 실험에 사용된 시 약 중에서 Sucrose (500 g), hydrogen peroxide (500 ml), hyperchlorite (500 ml), 2, 4-D (1 g), BA (1 g), carbon tetrachloride (1 g), carboxy methyl cellulose (500 g), olive oil (100 ml), silymarin (10 g)은 Sigma 회사, agar (1 kg)는 DifS회사로 부터 구입하여 사용하였다.
- 섭취시켰다. 구입한 동물들은 2주일간의 순화 사육과정을 거친 후 실험에 사용하였다.
- 사료는 (주)삼양사의 실험동물 고형사료를 구입하여 자유로이 공급하였으며, 음용수는 수돗물을 자유롭게 섭취시켰다. 구입한 동물들은 2주일간의 순화 사육과정을 거친 후 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 분리된 혈청 중 transaminase (GOT, GPT)의 활성 도 측정을 위해서 사용한 기질은 GOT의 경우 L-aspar-tic acid 와 a-ketoglutaric acid, GPT의 경우 L-alanine과 a-ketoglutaric acid이다 이들 기질을 사용하여 37℃ 에서 30분간 반응시킬 때 생성되는 pyruvic acid가 알칼리성 하에서 2, 4-dinitrophenyl hydrizine과 작용하여 발색되는 hydrazine의 비색을 정량하는 Reitman-Frankel 법15)에 의해 조제된 진단용 kit (아산제약, 한국)를 사용하여 파장 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. 활성도의 단위는 혈청 ml 당 Karmen unit로 표시하였다.
성능/효과
- 2시간이 경과한 후 사염화탄소를 투여한 결과, 혈청 중 GOT의 활성도는 대조군 949 Karmen unit 에대하여 검체군은 772.1 Karmen unit로 p<0.01의 상승 억제 효과를 보였으며, GPT의 활성도는 대조군 604 Kannen unit에 대하여 검체군은 556.4 Karmen units. p<Q01의 상승억제효과를 보였다(Table 1).
- 5 g/kg을 경구 투여하였다. 2시간이 경과한후 CCZ를 투여한 결과, 혈청 중 GOT의 활성도는 대조군 949 Karmen unit 에 대하여 검체군은 760.4 Karmen unit로 상승억제효과가 있었으며, GPT의 활성도는 대조군 604 Karmen unit 에 대하여 검체군은 540 Karmen unit로 상승억제효과를 보였다 (Table 1).
- 구기자의 혼합 생체시료와 세포배양 캘러스 추출물을 투여한 검체군에서의 GOT와 GPT 활성도는 대조군 (949와 604 Karmen unit)에 비하여 각각 760.4와540 Karmen, 772.1 와 556.4 Karmen unit unit 로 혈청 중 GOT, GPT의 상승억제효과가 있었으며, 비교약물 silymarin 100 ㎎/㎏ 투여군에서도 혈청 중의 GOT, GPT 활성도는 대조군의 949 및 604 Karmen unit에 대하여 각각 492.6 및 320.4 Karmen unit 로 p<0.05의 상승 억제효과가 있었다. 또한 검체 군은 양성대조군인 비교약물에 비하여 GOT, GPT 상승 억제 효과가 더 적은 것으로 나타났다.
- 그 결과 흰쥐에 5% 사염화탄소 (5 ml/kg)을 경구투여한 결과 GOT와 GPT치는 정상군 (83과 28.7 Karmen unit)에 비하여 사염화탄소 투여 대조군 (949 와 604 Karmen unit)에서 활성이 p<0.001의 유의적인 상승이 인정되었다.
- 그리고 비교약물 silymarin 100 ㎎/㎏ 투여군에서도 혈청 중의 GOT, GPT값은 각각 492.6 Karmen unit 와 320.4 Karmen unit로 pO.05의 상승 억제 효과를 보였으며, 또한 검체군 (캘러스 추출물)에 비하여 GOT, GPT 상승억제효과가 더 큰 것으로 나타났다 (Table 1).
- 있음을 알 수 있었다. 그리고 생체시료와 캘러스의 열수 추출물이 GOT 및 GPT 활성 상승 억제 효과에 있어서 통계학적인 유의성은 보이지 않았다.
- 낮기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 구기자 혼합 생체시료와 양^대조군인 sylimarine 사염화탄소로 유발된 간독성 흰쥐에서 GOT 및 GPT 활성의 상승을 억제하는 효과를 보이는 것으로 판단된다.
- 05의 상승 억제효과가 있었다. 또한 검체 군은 양성대조군인 비교약물에 비하여 GOT, GPT 상승 억제 효과가 더 적은 것으로 나타났다.
- 또한 흰쥐의 혈장 GOT 및 GPT 수준에 대한 구기자 혼합 생체시료의 효과를 비교 분석한 결과, 구기자 혼합 생체시료는 대조군에 비하여 GOT 및 GPT 수준이 감소하였으나, 양성대조군인 sylimarin 투여군에 비하여 높은 수준을 유지하는 것으로 나타났다.
- 비교약물 silymarin 100 ㎎/㎏ 투여군에서도 혈청 중의 GOT, GPT값은 대조군의 949 및 604 Karmen unit에 대하여 각각 492.6 및 320.4 Karmen unit로 p<0.05의 상승억제효과가 있었으며, 검체군에 비하여 GOT, GPT 상승억제효과가 더 큰 것으로 나타났다 (Table 1).
- 이러한 결과는 사염화탄소 투여 30분 전에 구기자 추출물을 경구 투여한 결과 정상군에 비하여 GOT와 GPT 활성도는 대조군 (191L0와 990.3 Karmen unit)에 비하여 구기자 투여군 (1502.2, 763.3 Karmen unit)이 p<0.05의 유의성 있는 GOT값의 상승 억제 효과가 있었으며, 비교약물 silymarin 100 ㎎/㎏ 경구투여 군에서도 혈청 중 GOT와 GPT값의 상승을 유의하게 억제시킴이 인정되었다는 보고7)와 일치하는 것으로 판단되지만 통계학적인 유의성은 인정되지 못하였다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 구기자 혼합 생체시료와 세포배양 캘러스의 열수 추출물은 간 독성흰쥐에서 GOT 및 GPT 상승에 대해 거의 동일한 억제 효과가 있음을 알 수 있었다. 그리고 생체시료와 캘러스의 열수 추출물이 GOT 및 GPT 활성의 상승 억제 효과에 있어서 통계학적인 유의성이 인정되지 못하였는데, 그 이유는 추출물이 충분하게 정제되지 못하였거나 또는 장기간 복용할 경우에만 약리효과가 나타나는 한방약제의 약리적 특성과 같이 구기자 열수 추출물의 투여기간이 너무 짧아서 유의할만한 간보호 효과를 보이지 못한 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 통하여 볼 때 구기자 혼합 생체시료와 세포배양 캘러스의 열수 추출물은 간독성 흰쥐에서 GOT 및 GPT 상승에 대해 거의 동일한 억제 효과가 있음을 알 수 있었다. 그리고 생체시료와 캘러스의 열수 추출물이 GOT 및 GPT 활성 상승 억제 효과에 있어서 통계학적인 유의성은 보이지 않았다.
- 이와 같이 구기자의 혼합 생체시료, 세포배양 캘러스 그리고 양성대조군인 sylimarine 사염화탄소로 유발된 간독성 흰쥐에서 GOT 및 GPT의 활성도 상승을 억제하는 효과를 보이는 것으로 판단된다.
- 흰쥐에 5% 사염화탄소 5 ml/kg을 경구 투여하였을 때 혈청 중의 GOT치는 사염화탄소를 투여하지 않은 정상군의 83 Kannen unit에 대하여 사염화탄소투여 대조군은 949 Karmen unit, GPT치는 정상군의 28.7 Karmen unit에 대하여 대조군은 604 Karmen unit로 각각 p<Q001의 유의한 GOT 및 GPT치의 상승이 인정되었다 (Table 1).
후속연구
- 있음을 알 수 있었다. 그리고 생체시료와 캘러스의 열수 추출물이 GOT 및 GPT 활성의 상승 억제 효과에 있어서 통계학적인 유의성이 인정되지 못하였는데, 그 이유는 추출물이 충분하게 정제되지 못하였거나 또는 장기간 복용할 경우에만 약리효과가 나타나는 한방약제의 약리적 특성과 같이 구기자 열수 추출물의 투여기간이 너무 짧아서 유의할만한 간보호 효과를 보이지 못한 것으로 생각된다.
- 추후의 연구에서는 대량 증식된 캘러스 배양세포로부터 순수한 betaine을 분리할 수 있는 분리, 정제방법과 betaine 생산에 관여하는 유전자를 분리하여 betaine 생산을 유전적으로 조절하는 방법 그리고 세포배양을 통하여 정제된 betaine의 약리적 작용기전 및 기타 한방 약리효과를 보이는 구기자의 유용성분의 분리, 정제를 통한 의약품 또는 자양 강장제의 개발 등에 대한 연구가 수행되어야 할 것이다.
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