[논문]Di-2-ethylhexyl phthalate 처리 남아프리카산발톱개구리에서의 vitellogenin 발현

박응로; 이철우; 류지성; 남성숙; 전성환; 나진균; 최덕일; 박광식

문제 정의

본 연구에서는 DEHP를 수컷의 남아프리카산발 톱개구리 (Xenoptzs ZaevZs)에 처리한 후 reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 법 을 이용하여 vitellogenin mRNA의 발현에 대 하여 조사하고 간과 testis를 대상으로 조직학적 조사를 수행함으로써 DEHP가 내분비계 장애 영향을 나 타내는지를 검토하였다. 아울러 RT-PCR법을 이 용하여 양서류에서 내분비계 장애물질의 영향을 평가할 수 있는 분자생물학적 지표를 개발하고자 하였다.
본 연구에서는 DEHP를 수컷의 남아프리카산발 톱개구리 (Xenoptzs ZaevZs)에 처리한 후 reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 법 을 이용하여 vitellogenin mRNA의 발현에 대 하여 조사하고 간과 testis를 대상으로 조직학적 조사를 수행함으로써 DEHP가 내분비계 장애 영향을 나 타내는지를 검토하였다. 아울러 RT-PCR법을 이 용하여 양서류에서 내분비계 장애물질의 영향을 평가할 수 있는 분자생물학적 지표를 개발하고자 하였다.
, 1993) 또는 Western blotting을 이 용한 시험 (Palmer and Palmer, 1995), Northern blot을 이용한 mRNA 시험 등 vitellogenin 발현을 측정하여 내분비계장애 영향을 평가하기 위한 많은 시험법이 개발되어 있지만, RT-PCR을 이용하여 vitellogenin mRNA의 발현을 조사하는 방법은 감도가 뛰어나 극소량 발현되는 mRNA도 검출할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 시험에서는 남아프리카산발톱개구리의 간에서 추출한 RNA에 Kloas 등(1999)이 사용한 primer를 적용, RT-PCR을 수행하여 vitellogenin mRNA의 발현을 조사함으로써 내분비계 장애영 향 평가에 RT-PCR을 이용한 vitellogenin mRNA 검출법의 적용 가능성을 조사하고, 이 방법을 이용하여 DEHP의 estrogenicity를 검토하였다.

제안 방법

8g의 성체를 사용하였다. 시험 개체는 탈염소한 수돗물에서 사육하고 잘게 자른 소간을 주 3회 급이하였다.
노출농도는 DEHP를 에탄올에 녹인 후 국내산 개구리의 체내에서 검출된 적 이 있는 최대 농도인 3OOjig/kg, 그보다 1, 000배 높은 농도인 300mg/kg의 2개 농도 군으로 하여 50 ul씩 등쪽의 림프 주머니에 주사하였으며 96시간이 지난 후 장기를 적출하여 시료로 사용하였다 (국립환경 연구원, 2000). Vitello- genin mRNA의 발현을 조사하기 위하여 간을 적 출하고 total RNA를 추출하였으며, 간과 testis의 조직 학적 관찰을 위해 장기를 적출한 후 Bouin 용액에 고정하였다. 양성대조군으로는 17(3-estradiol을 개구리 체중당 300pig/kg으로 처리하였으며 무수 에탄올만을 주사한 것을 음성대조군으로 사용하였다.
Vitello- genin mRNA의 발현을 조사하기 위하여 간을 적 출하고 total RNA를 추출하였으며, 간과 testis의 조직 학적 관찰을 위해 장기를 적출한 후 Bouin 용액에 고정하였다. 양성대조군으로는 17(3-estradiol을 개구리 체중당 300pig/kg으로 처리하였으며 무수 에탄올만을 주사한 것을 음성대조군으로 사용하였다. 한편 시 험수는 사육조건과 마찬가지로 탈 염소한 수돗물을 사용하였다.
시험물질의 처리가 완료된 개체를 에탄올에 0.05% 농도로 녹인 benzocaine (Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액에서 마취시킨 후, 해부하여 간을 50—100 mg 적출하고 TRIzol® reagent (Life Tech nologies, Grand Island, NY, USA)-> 이용하여 total RNA를 추출하였다. 260 nm에서 흡광도를 측정하여 추출한 RNA의 농도를 계산하였으며 이 중 1 ug을 RT-PCR 반응에 사용하였다.
260 nm에서 흡광도를 측정하여 추출한 RNA의 농도를 계산하였으며 이 중 1 ug을 RT-PCR 반응에 사용하였다. Vitellogenin pri- mer로는 forward 5'-egg eta tat caa act ttt tgg c-3', reverse 5'-gtt ttc ttg aaa tgg agg c-3으] 서열을 가지는 남아프리카산 발톱개 리의 vitellogeninpri- mer(Kloas et al., 1999)-f- 합성하였으며, 대조 프라이머로는 elongation factor la primer (forward 5'- tgc caa ttg ttg aca tga tcc c-3', reverse 5'-tac tat taa act etg atg gcc-3, )를 합성하여 사용하였다 (Kloas et al., 1999).
2 ug의 RNA와 5U의 AMV Reverse Transcriptase XL (Takara Shuzo Co., Ltd. Otsu, Shiga, Japan)을 사용하여 30℃(10분), 55℃ (30분), 99℃ (5분), 5℃ (5분)의 조건에서 반응시켜 20pl의 cDNA를 합성하였다. PCR 반응은 10 X buffer 10 ul (100 mM Tris -HC₁, pH 8.
5U의 Taq polymerase를 혼합하여 반응시켰다. 이 때의 총부피는 100ul이 었으며 94℃(60초), 59℃(60초), 72℃(120초)를 1주기로 하여 총 36회 반응 켰다. 증폭된 cDNA 단편 중 5 u1를 취하여 ethydium bromide (5 p.
이 때의 총부피는 100ul이 었으며 94℃(60초), 59℃(60초), 72℃(120초)를 1주기로 하여 총 36회 반응 켰다. 증폭된 cDNA 단편 중 5 u1를 취하여 ethydium bromide (5 p.1/100 포함된 1.0% agarose gel에서 전기 영동하여 그 결과를 확인하였다.
. 간과 정 소를 적출한 후 Bouin 용액에 12시간씩 2회 고정하고 에탄올 시리즈 (70%, 80%, 90%, 95%, 무수에탄올)로 조직을 탈수시킨 후 xylen 투명과정을 거쳐 파라핀을 침투시켰다. Embedding center (RMC TEC)를 이용하여 포매 하고 5 um이 두께로 박절한 후, hematoxylin과 eosin으로 염색하여 현미경으로 검경하였다.
간과 정 소를 적출한 후 Bouin 용액에 12시간씩 2회 고정하고 에탄올 시리즈 (70%, 80%, 90%, 95%, 무수에탄올)로 조직을 탈수시킨 후 xylen 투명과정을 거쳐 파라핀을 침투시켰다. Embedding center (RMC TEC)를 이용하여 포매 하고 5 um이 두께로 박절한 후, hematoxylin과 eosin으로 염색하여 현미경으로 검경하였다.
남아프리카산발톱개구리 수컷의 림프주머니에 DEHP를 주사하고 96시간이 경과한 후 RT-PCR을 이용하여 vitellogenin mRNA의 발현을 조사하였다. 모든 시험군에서 이 ongatioii factorla cDNA 가 기 보고된 것과 일치된 285 bp 위치에서 나타났으며 그 발현 정도도 거의 일정하였다.
이것은 Kloas 등(1999)이 보고한 것과 같은 크기로서 외부 estrogen 자극에 의해 유도된 vitellogenin mRNA가 in vivo 시험 에서 효과적으로 검출되었음을 보여준다. 본 시험에서는 생태 영향 조사 결과를 바탕으로 개구리의 체내에서 검출된 DEHP의 최고 검출농도인 300 jig/kg4 이보다 1, 000배 높은 300mg/kg을 노출 농도로 결정하고 남아프리카산발톱개구리의 림프주머니에 주사한 뒤 96시간이 지난 후 RT-PCR법을 이용하여 vitellogenin mRNA의 발현을 조사하였다. 전기 영 동으로 분석한 결과 300 ug/kg 처리군에서는 mRNA의 발현이 전혀 검출되지 않았으며 300 mg/kg 처 리 군에서 529 bp 크기의 band가 확인되 었 다.

대상 데이터

시험 생물로는 Ann Arbor Biological Center (Mi- chigan, USA)에서 수입하여 국립환경연구원 수서 생물사육실에서 1년간 유지, 관리한 남아프리카산 발톱개구리 (Xenopus laevis) 수컷을 사용하였으며 시험에는 완전히 성숙한 체중 50.9±5.8g의 성체를 사용하였다. 시험 개체는 탈염소한 수돗물에서 사육하고 잘게 자른 소간을 주 3회 급이하였다.
시험물질은 DEHP를 사용하였다. 노출농도는 DEHP를 에탄올에 녹인 후 국내산 개구리의 체내에서 검출된 적 이 있는 최대 농도인 3OOjig/kg, 그보다 1, 000배 높은 농도인 300mg/kg의 2개 농도 군으로 하여 50 ul씩 등쪽의 림프 주머니에 주사하였으며 96시간이 지난 후 장기를 적출하여 시료로 사용하였다 (국립환경 연구원, 2000).
시험물질은 DEHP를 사용하였다. 노출농도는 DEHP를 에탄올에 녹인 후 국내산 개구리의 체내에서 검출된 적 이 있는 최대 농도인 3OOjig/kg, 그보다 1, 000배 높은 농도인 300mg/kg의 2개 농도 군으로 하여 50 ul씩 등쪽의 림프 주머니에 주사하였으며 96시간이 지난 후 장기를 적출하여 시료로 사용하였다 (국립환경 연구원, 2000). Vitello- genin mRNA의 발현을 조사하기 위하여 간을 적 출하고 total RNA를 추출하였으며, 간과 testis의 조직 학적 관찰을 위해 장기를 적출한 후 Bouin 용액에 고정하였다.

성능/효과

남아프리카산발톱개구리 수컷의 림프주머니에 DEHP를 주사하고 96시간이 경과한 후 RT-PCR을 이용하여 vitellogenin mRNA의 발현을 조사하였다. 모든 시험군에서 이 ongatioii factorla cDNA 가 기 보고된 것과 일치된 285 bp 위치에서 나타났으며 그 발현 정도도 거의 일정하였다. 또한 17p-estradiol 처리 군에서 vitellogenin A2 유전자 단편과 같은 크기인 529 bp에서 band가 검출되었다.
또한 17p-estradiol 처리 군에서 vitellogenin A2 유전자 단편과 같은 크기인 529 bp에서 band가 검출되었다. 한편 DEHP를 처리한 시험군은 300mg/kg을 주사한 경우에서 529 bp 크기의 cDNA 단편이 검출되었으나 그 양은 17|3-estradiol 처리군에 비해 매우 적었으며 3OOng/kg을 주사한 개체에서는 vitellogenin 유전자로 추정되는 어떠한 PCR 산물도 관찰되지 않았다. 또한 무처리군과 무수에탄올만을 처리한 음성대조군에서도 elongation factor la 이외의 어떠한 유전자 단편도 검출되지 않았다 (Fig.
시험 결과 Fig. 1에 보인 바와 같이 모든 시험군 에서 거의 일정한 양의 elongation factor la cDNA가 285 bp 크기에서 발현되었으며 1713-estradiol 처리군에서 vitellogenin cDNA가 529 bp 크기에서 검출되었다. 이것은 Kloas 등(1999)이 보고한 것과 같은 크기로서 외부 estrogen 자극에 의해 유도된 vitellogenin mRNA가 in vivo 시험 에서 효과적으로 검출되었음을 보여준다.
본 시험에서는 생태 영향 조사 결과를 바탕으로 개구리의 체내에서 검출된 DEHP의 최고 검출농도인 300 jig/kg4 이보다 1, 000배 높은 300mg/kg을 노출 농도로 결정하고 남아프리카산발톱개구리의 림프주머니에 주사한 뒤 96시간이 지난 후 RT-PCR법을 이용하여 vitellogenin mRNA의 발현을 조사하였다. 전기 영 동으로 분석한 결과 300 ug/kg 처리군에서는 mRNA의 발현이 전혀 검출되지 않았으며 300 mg/kg 처 리 군에서 529 bp 크기의 band가 확인되 었 다. 그러나 대조군으로 사용한 17|3-estradiol(300 ug/kg)의 경우와 비교하였을 때보다도 발현량이 훨씬 약한 것으로 보아 DEHP의 vitellogenin 유도 능은 17[3-estradiol의 1/1000 이하인 것으로 판단된다.
전기 영 동으로 분석한 결과 300 ug/kg 처리군에서는 mRNA의 발현이 전혀 검출되지 않았으며 300 mg/kg 처 리 군에서 529 bp 크기의 band가 확인되 었 다. 그러나 대조군으로 사용한 17|3-estradiol(300 ug/kg)의 경우와 비교하였을 때보다도 발현량이 훨씬 약한 것으로 보아 DEHP의 vitellogenin 유도 능은 17[3-estradiol의 1/1000 이하인 것으로 판단된다.
한편 단기 노출의 결과를 평가한 본 연구에서 조직학적인 변화는 전혀 나타나지 않았음에도 RT -PCR로는 vitellogenin mRNA의 발현을 검출할 수 있었다. 본 실험에 사용한 프라이머가 참개구 리, 산개구리, 황소개구리와 같은 국내 서식 개구 리에도 적용될 수 있는지는 검토되어야 하겠지만 RT-PCR법을 이용한 비텔로제닌 검출 방법은 양서류에서 내분비계 장애물질의 영향을 모니터링하는데 좋은 지표가 될 수 있을 것으로 판단된다.

후속연구

DEHP는 급성독성은 매우 약하지만 (rat의 경구 LD50 = 30, 600 mg/kg) 발암성, 변이 원성, 생식 독성을 가지는 것으로 알려져있다(국립환경연구원, 1999). 본 실험의 결과로부터 국내산 개구리 및 어류의 체내에서 검출된 농도의 DEHP에 의해 단기간내 에 vitellogenin의 유도나 조직학적인 이상은 발생하지 않을 것으로 판단되지만 DEHP 노출 이후 시간경과에 따른 vitellogenin 유도와 다른 물질과 혼재할 경우의 상승효과, 지속적인 노출에 의한 영향 등은 검토되 지 않았고, vitellogenin mRNA 유도가 아닌 다른 측면의 내분비계 장애영향에 대해서는 조사된 바가 없으므로 이에 대한 종합적인 연구가 수행될 때까지는 국내산 수서생물의 DEHP 오염 결과에 주목하여야 할 것이다.
한편 단기 노출의 결과를 평가한 본 연구에서 조직학적인 변화는 전혀 나타나지 않았음에도 RT -PCR로는 vitellogenin mRNA의 발현을 검출할 수 있었다. 본 실험에 사용한 프라이머가 참개구 리, 산개구리, 황소개구리와 같은 국내 서식 개구 리에도 적용될 수 있는지는 검토되어야 하겠지만 RT-PCR법을 이용한 비텔로제닌 검출 방법은 양서류에서 내분비계 장애물질의 영향을 모니터링하는데 좋은 지표가 될 수 있을 것으로 판단된다.

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