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문제 정의
- 본 연구에서는 aflatoxin 생성균주인 A. flavus 15517, patulin 생성균주인 P. griseofiilvum 및 곰팡이독소를 생성하지 않는 A. aiger을 혼합배양하여 aflatoxin 및 patulin 생성능을 조사하여 그 결과를 보고한다.
제안 방법
- 배양물의 patulin 분석은 AOAC(Association of Official Analytical Chemists)법끄'을 참고로 하여 배양물에 ethyl acetate# 5 ml 첨가하여 주줄한 후 speed vacuum concen- trator로 농축하여 농축된 시료를 ethanol에 용해시켜 Peter 등23의 방법을 참고하여 TLC를 행하였다. TLC plate를 100~110℃ 건조기에서 2시간 동안 활성화시킨 후 농축액을 spotting하여 전개용매 (toluene:ethyl acetate:formic acid=5:4:1, v/v)가 포화된 전개조에서 선개시킨 다음 표준 patulin과 같은 Rf치의 band만을 잘라 ethanee] 용해시킨 후 직경 2 μm membrane filter(millipore filter)로 여과하여 여액을 HPLC용 시료로 하여 분석하였으며 HPLC 분석조건은 Table 1과 같다.
- 균의 생육도는 배양한 배양물을 멸균한 후 균체 (mycelium)를 취하여 증류수로 세척하고 Whatman No. 4 filter paper로 여과한 다음 60℃의 dry oven에서 24시간 건조시켜 방냉한 후 항량이 된 무게에서 filter paper의 무게를 제외한 무게를 측정하여 생육도늘 조사하였다.
- 이 시료용액과 aflatoxin B1-oxime-horse radish peroxidase (HRP) 희석액(300배)을 동일량 혼합하여 100μ1씩 well에 주입한 후 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 세척용 완충액으로 다시 씻은 plate는 일정량의 기질용액[ABTS; 2,2'-azino-bis(3-ethyl benzthiazoline-6-sulfbnic acid)]을 첨가하여 결합된 aflatoxin B「oxime-HRP를 발색시키고 10분 후 반응정지액 100μ1씩을 가하여 반응을 정지시킨 다음 ELISA reader(Dynatech Lab. MR 600, U.S.A.)로 흡광도를 측정하여 표준곡선과 비교히여 그 함량을 계산하였다. 이때 작성된 표준곡선은 Fig.
- 05%의 Tween 20을 첨가한 혼합액인 세척용 완충액 (washing buffer)으로 세척하였다. 시료용액액 조제는 시료에 methanol:water(70:30, v/v) 혼합액을 5배 첨가하여 5분 동안 혼합한 다음 Whatman No.4 여과지로 여과하여 여액을 ELISA에 의한 분석용 시료로 하였다. 이 시료용액과 aflatoxin B1-oxime-horse radish peroxidase (HRP) 희석액(300배)을 동일량 혼합하여 100μ1씩 well에 주입한 후 37℃에서 30분 동안 배양하였다.
- 시험관 (12x150mm)에 SLS배지[Sucrose, 8.5%(w/v); L-asparagine, l%(w/v); (NH4)2SO4, 0.2%(w/v); KH, PO4, 0.2 %(w/v); MgSO4 - 6H2O, 0.1%(w/v); CaCl2 - 2H2O, 0.0075% (w/v); N&B4O7, 0.0002%(w/v); FeSO4 . 6H2O, 0.0002%(w/v); MnCl, . 4H20, 0.0005%(w/v); Ammonium molybdate, 0.0002%(w/v); pH 5.6] 5 ml씩을 첨가하고 고압증기멸균한 다음 포자현탁액을 단독 또는 혼합접종하여 28℃에서 0, 3, 6, 9, 12, 15일간 정치배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 곰팡이독소 생성 균주는 분양 받아 보관중인 aflatoxin 생성균주인 A. flavus 15517과 patulin 생성균주인 P. griseofulvum이었고, 곰팡이독소를 생성하지 않는 균주로는 본 실험실에서 분리하여 보관중인 A. aiger를 사용하였다
이론/모형
- 배양물의 aflatoxin B, 분석은 본 실험실에서 확립한 direct competitive enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)법을 사용하였다. ELISA용 plate준비는 본 실험실에서 생산하여 보관하고 있는 항체를 phosphate buffer solution(PBS 0.
- 배양물의 patulin 분석은 AOAC(Association of Official Analytical Chemists)법끄'을 참고로 하여 배양물에 ethyl acetate# 5 ml 첨가하여 주줄한 후 speed vacuum concen- trator로 농축하여 농축된 시료를 ethanol에 용해시켜 Peter 등23의 방법을 참고하여 TLC를 행하였다. TLC plate를 100~110℃ 건조기에서 2시간 동안 활성화시킨 후 농축액을 spotting하여 전개용매 (toluene:ethyl acetate:formic acid=5:4:1, v/v)가 포화된 전개조에서 선개시킨 다음 표준 patulin과 같은 Rf치의 band만을 잘라 ethanee] 용해시킨 후 직경 2 μm membrane filter(millipore filter)로 여과하여 여액을 HPLC용 시료로 하여 분석하였으며 HPLC 분석조건은 Table 1과 같다.
- 배양액의 aflatoxin B1은 앞에서 설명한 방법과 같이 본 실험실에서 확립한 direct competitive ELISA법을 사용하여 조사하였다. 이때 항체는 aflatoxin G group과는 교차반응이 낮았지만 aflatoxin B group과는 100~118%의 높은 교차반응을 나타내는 특이성을 가지고 있으며 (Table 2), 표준 aflatoxin B1의 농도에 따라 예민하게 반응하였다.
성능/효과
- flavus.A. niger 및 P. griseofulvum 3균주의 혼합배양으로 patulin 생성이 69.5% 감소되어 23.72[ig/ml의 생성을 보였다.
- Aflatoxin 생성균주인 A. flavus 15517과 patulin 생성균주 인 P. griseofiilvum 및 곰팡이독소를 생성하지 않는 A. niger을 혼합배양하여 aflatoxin 및 patulin 생성능에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하기 위하여 균주를 단독 또는 혼합배양하면서 균의 생육도를 조사한 결과, Fig. 2에서와 같이 균 생육의 경우 일반적으로 생육이 늦은 P. griseofiilvume 제외하고 대 체로 비슷한 균의 생육 정도를 보였지만 A. nigere R griseofiilvum 혼합배양의 경우 균의 생육이 다른 구간보다 오히려 크게 나타나 12일째에 211mg/tube의 균체량을 보여, 혼합배양이 균생육에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- Patulin의 경우도 혼합배양으로 크게 감소하여 Table 4에서 보는 바와 같이 P. griseofiilvum 단독배양의 경우 12일째 77.82)μg/ml를 나타내었으며 A. flavus 또는 A. niger와의 혼합배양시 patulin 생성의 감소를 보였으며 특히, A. flavus.A.
- 공시균을 혼합배양하여 ELISA법으로 A. Jlavus의 aflatoxin B1 생성에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 3과 같이 A. flavus 단독으로 배양시 시간이 경과할수록 많은 aflatoxin의 생성을 확인할 수 있었으며 배양 15일째에는 137.13의 aflatoxin Bt 생성이 확인되었으나 A. niger와의 혼합배양으로 그 함량이 크게 줄어들었으며 P griseoj니의 혼합배양에서도 aflatoxin B, 생성이 줄어드는 결과를 볼 수 있었다. 또한 A.
- Mori 둥(1)은 시판되고 있는 분말상 식품의 유해 미생물 오염 정도를 조사한 봐, 오염된 23주의 Aspergilluse ‘Author to whom correspondence should be addressed. 균주 중 10주가 Aspergillus /Zqvms였음을 밝혔고, Ichinoe 등 (2)도 맥류로부터 유래된 사상균의 곰팡이독소 생성능을 조사한 결과, 분리된 Aspergillus flavus 58주중 15.5%에 해당되는 9주에서 aflatoxin이 검출되었다고 발표함으로써 맥류의 저장, 유통, 관리상에 문제점이 있음을 지적하였다.
- niger와의 혼합배양으로 그 함량이 크게 줄어들었으며 P griseoj니의 혼합배양에서도 aflatoxin B, 생성이 줄어드는 결과를 볼 수 있었다. 또한 A. flavus, A. niger 및 P. griseojulvum%: 혼합 배양 시 12일째에는 93%가 감소하여 10.16㎍/ml의 aflatoxin 乌생성을 보였다.
- 또한 배양액의 pH 변화 및 산생성량을 조사한 결과 Fig.3과 Fig. 4에 나타난 바와 같이 pH는 A. nigere 같이 혼합배양한 군에서 pH가 대체로 낮고, 산생성량은 높게 나타나는 경향을 보였다. 그렇지만 A.
- fiimigatusye 억제 효과를 가짐을 보고하였다. 본 연구의 결과에서도 서로 다른 곰팡이의 혼합배양으로 단독배양에서와는 달리 혼합배양 시 균 상호간의 경쟁작용과 다양한 대사산물의 생성으로 특정 곰팡이의 대사에 방해를 받으며 특히 곰팡이독소의 경우 생성이 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 또한 본 연구에서도 배양 중 산의 생성뿐만 아니라 다양한 성분이 있는 바, 곰팡이독소 생성을 억제할 수 있는 다른 요인들의 작용 가능성도 배제할 수 없다.
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