Aspeygillus flavus, Aspergillus nicer 및 Peniciilum griseofulvum의 혼합배양이 aflatoxin 및 patulin 생성에 미치는 영향 The Effects of Mixed Culture with Aspergillus flavus, Aspergilus niger and Penicillium griseofulvum on Aflatoxin and Patulin Production원문보기
곰팡이독소 생성균과 비생성균의 혼합배양이 곰팡이독소 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Aspergillus flavus (aflatoxin 생성균), Aspergillus nigey(비생성균) 그리고 Penicillium griseofulvum (patulin 생성균)을 5 ml의 SLS 배지에서 15일동안 단독 혹은 혼합배양하였다. Afatoxin의 생성능의 측정은 직접경쟁 ELISA법으로, patulin은 HPLC 법으로 생성능을 측정하였으며, 균의 생육도, pH 그리고 산생성량을 상법에 따라 측정하였다. 그 결과 혼합배양은 전체적으로 균의 생육도를 크게 저하시키지 않은 반면, 산의 생성증가로 pH의 감소를 보였다. Aflatoxin은 12일간의 단독배양시 145 $\mu\textrm{g}$/ml이 생성되었으나 혼합배양으로 93%이상이 감소되어 10.26$\mu\textrm{g}$/ml을 생성하였다. Patulin의 경우도 혼합배양으로 단독배양시의 77.82$\mu\textrm{g}$/ml에 비하여 69.5%가 감소된 23.72$\mu\textrm{g}$/ml 수준을 나타내었다.
곰팡이독소 생성균과 비생성균의 혼합배양이 곰팡이독소 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Aspergillus flavus (aflatoxin 생성균), Aspergillus nigey(비생성균) 그리고 Penicillium griseofulvum (patulin 생성균)을 5 ml의 SLS 배지에서 15일동안 단독 혹은 혼합배양하였다. Afatoxin의 생성능의 측정은 직접경쟁 ELISA법으로, patulin은 HPLC 법으로 생성능을 측정하였으며, 균의 생육도, pH 그리고 산생성량을 상법에 따라 측정하였다. 그 결과 혼합배양은 전체적으로 균의 생육도를 크게 저하시키지 않은 반면, 산의 생성증가로 pH의 감소를 보였다. Aflatoxin은 12일간의 단독배양시 145 $\mu\textrm{g}$/ml이 생성되었으나 혼합배양으로 93%이상이 감소되어 10.26$\mu\textrm{g}$/ml을 생성하였다. Patulin의 경우도 혼합배양으로 단독배양시의 77.82$\mu\textrm{g}$/ml에 비하여 69.5%가 감소된 23.72$\mu\textrm{g}$/ml 수준을 나타내었다.
This experiment was conducted to investigate the effects of mixed culture with mycotoxigenic and non-mycotoxigenic fungi on mycotoxin production. For this work, Aspegillus flavus (aflatoxin producing strain), Aspegillus niger (non-mycotoxigenic strain) and Penicillium griseofulvum (patulin producing...
This experiment was conducted to investigate the effects of mixed culture with mycotoxigenic and non-mycotoxigenic fungi on mycotoxin production. For this work, Aspegillus flavus (aflatoxin producing strain), Aspegillus niger (non-mycotoxigenic strain) and Penicillium griseofulvum (patulin producing strain)were cultured in 5 ml SLS medium for 15 days under single or mixed culture. Aflatoxin was determined by direct competitive ELISA, whereas, patulin was measured by HPLC. The mycelial growth, pH and total acidity were also observed by general methods. The mycelial growth was slightly decreased in the mixed culture, meanwhile total acidity was increased and pH was shown lower than that in single culture. Aspergillus flavus produced 145 $\mu\textrm{g}$/ml of aflatoxin for 12 days single culture, but in mixed culture, aflatoxin was decreased to 93%, and was shown as 10.16$\mu\textrm{g}$/ml level. Patulin production in mixed culture was also decreased to 69.3% and was shown only 23.72$\mu\textrm{g}$/ml level as compared with in single culture.
This experiment was conducted to investigate the effects of mixed culture with mycotoxigenic and non-mycotoxigenic fungi on mycotoxin production. For this work, Aspegillus flavus (aflatoxin producing strain), Aspegillus niger (non-mycotoxigenic strain) and Penicillium griseofulvum (patulin producing strain)were cultured in 5 ml SLS medium for 15 days under single or mixed culture. Aflatoxin was determined by direct competitive ELISA, whereas, patulin was measured by HPLC. The mycelial growth, pH and total acidity were also observed by general methods. The mycelial growth was slightly decreased in the mixed culture, meanwhile total acidity was increased and pH was shown lower than that in single culture. Aspergillus flavus produced 145 $\mu\textrm{g}$/ml of aflatoxin for 12 days single culture, but in mixed culture, aflatoxin was decreased to 93%, and was shown as 10.16$\mu\textrm{g}$/ml level. Patulin production in mixed culture was also decreased to 69.3% and was shown only 23.72$\mu\textrm{g}$/ml level as compared with in single culture.
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문제 정의
본 연구에서는 aflatoxin 생성균주인 A. flavus 15517, patulin 생성균주인 P. griseofiilvum 및 곰팡이독소를 생성하지 않는 A. aiger을 혼합배양하여 aflatoxin 및 patulin 생성능을 조사하여 그 결과를 보고한다.
제안 방법
배양물의 patulin 분석은 AOAC(Association of Official Analytical Chemists)법끄'을 참고로 하여 배양물에 ethyl acetate# 5 ml 첨가하여 주줄한 후 speed vacuum concen- trator로 농축하여 농축된 시료를 ethanol에 용해시켜 Peter 등23의 방법을 참고하여 TLC를 행하였다. TLC plate를 100~110℃ 건조기에서 2시간 동안 활성화시킨 후 농축액을 spotting하여 전개용매 (toluene:ethyl acetate:formic acid=5:4:1, v/v)가 포화된 전개조에서 선개시킨 다음 표준 patulin과 같은 Rf치의 band만을 잘라 ethanee] 용해시킨 후 직경 2 μm membrane filter(millipore filter)로 여과하여 여액을 HPLC용 시료로 하여 분석하였으며 HPLC 분석조건은 Table 1과 같다.
균의 생육도는 배양한 배양물을 멸균한 후 균체 (mycelium)를 취하여 증류수로 세척하고 Whatman No. 4 filter paper로 여과한 다음 60℃의 dry oven에서 24시간 건조시켜 방냉한 후 항량이 된 무게에서 filter paper의 무게를 제외한 무게를 측정하여 생육도늘 조사하였다.
이 시료용액과 aflatoxin B1-oxime-horse radish peroxidase (HRP) 희석액(300배)을 동일량 혼합하여 100μ1씩 well에 주입한 후 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 세척용 완충액으로 다시 씻은 plate는 일정량의 기질용액[ABTS; 2,2'-azino-bis(3-ethyl benzthiazoline-6-sulfbnic acid)]을 첨가하여 결합된 aflatoxin B「oxime-HRP를 발색시키고 10분 후 반응정지액 100μ1씩을 가하여 반응을 정지시킨 다음 ELISA reader(Dynatech Lab. MR 600, U.S.A.)로 흡광도를 측정하여 표준곡선과 비교히여 그 함량을 계산하였다. 이때 작성된 표준곡선은 Fig.
05%의 Tween 20을 첨가한 혼합액인 세척용 완충액 (washing buffer)으로 세척하였다. 시료용액액 조제는 시료에 methanol:water(70:30, v/v) 혼합액을 5배 첨가하여 5분 동안 혼합한 다음 Whatman No.4 여과지로 여과하여 여액을 ELISA에 의한 분석용 시료로 하였다. 이 시료용액과 aflatoxin B1-oxime-horse radish peroxidase (HRP) 희석액(300배)을 동일량 혼합하여 100μ1씩 well에 주입한 후 37℃에서 30분 동안 배양하였다.
본 실험에 사용한 곰팡이독소 생성 균주는 분양 받아 보관중인 aflatoxin 생성균주인 A. flavus 15517과 patulin 생성균주인 P. griseofulvum이었고, 곰팡이독소를 생성하지 않는 균주로는 본 실험실에서 분리하여 보관중인 A. aiger를 사용하였다
이론/모형
배양물의 aflatoxin B, 분석은 본 실험실에서 확립한 direct competitive enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)법을 사용하였다. ELISA용 plate준비는 본 실험실에서 생산하여 보관하고 있는 항체를 phosphate buffer solution(PBS 0.
배양물의 patulin 분석은 AOAC(Association of Official Analytical Chemists)법끄'을 참고로 하여 배양물에 ethyl acetate# 5 ml 첨가하여 주줄한 후 speed vacuum concen- trator로 농축하여 농축된 시료를 ethanol에 용해시켜 Peter 등23의 방법을 참고하여 TLC를 행하였다. TLC plate를 100~110℃ 건조기에서 2시간 동안 활성화시킨 후 농축액을 spotting하여 전개용매 (toluene:ethyl acetate:formic acid=5:4:1, v/v)가 포화된 전개조에서 선개시킨 다음 표준 patulin과 같은 Rf치의 band만을 잘라 ethanee] 용해시킨 후 직경 2 μm membrane filter(millipore filter)로 여과하여 여액을 HPLC용 시료로 하여 분석하였으며 HPLC 분석조건은 Table 1과 같다.
배양액의 aflatoxin B1은 앞에서 설명한 방법과 같이 본 실험실에서 확립한 direct competitive ELISA법을 사용하여 조사하였다. 이때 항체는 aflatoxin G group과는 교차반응이 낮았지만 aflatoxin B group과는 100~118%의 높은 교차반응을 나타내는 특이성을 가지고 있으며 (Table 2), 표준 aflatoxin B1의 농도에 따라 예민하게 반응하였다.
성능/효과
flavus.A. niger 및 P. griseofulvum 3균주의 혼합배양으로 patulin 생성이 69.5% 감소되어 23.72[ig/ml의 생성을 보였다.
Aflatoxin 생성균주인 A. flavus 15517과 patulin 생성균주 인 P. griseofiilvum 및 곰팡이독소를 생성하지 않는 A. niger을 혼합배양하여 aflatoxin 및 patulin 생성능에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하기 위하여 균주를 단독 또는 혼합배양하면서 균의 생육도를 조사한 결과, Fig. 2에서와 같이 균 생육의 경우 일반적으로 생육이 늦은 P. griseofiilvume 제외하고 대 체로 비슷한 균의 생육 정도를 보였지만 A. nigere R griseofiilvum 혼합배양의 경우 균의 생육이 다른 구간보다 오히려 크게 나타나 12일째에 211mg/tube의 균체량을 보여, 혼합배양이 균생육에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
Patulin의 경우도 혼합배양으로 크게 감소하여 Table 4에서 보는 바와 같이 P. griseofiilvum 단독배양의 경우 12일째 77.82)μg/ml를 나타내었으며 A. flavus 또는 A. niger와의 혼합배양시 patulin 생성의 감소를 보였으며 특히, A. flavus.A.
공시균을 혼합배양하여 ELISA법으로 A. Jlavus의 aflatoxin B1 생성에 미치는 영향을 조사한 결과는 Table 3과 같이 A. flavus 단독으로 배양시 시간이 경과할수록 많은 aflatoxin의 생성을 확인할 수 있었으며 배양 15일째에는 137.13의 aflatoxin Bt 생성이 확인되었으나 A. niger와의 혼합배양으로 그 함량이 크게 줄어들었으며 P griseoj니의 혼합배양에서도 aflatoxin B, 생성이 줄어드는 결과를 볼 수 있었다. 또한 A.
Mori 둥(1)은 시판되고 있는 분말상 식품의 유해 미생물 오염 정도를 조사한 봐, 오염된 23주의 Aspergilluse ‘Author to whom correspondence should be addressed. 균주 중 10주가 Aspergillus /Zqvms였음을 밝혔고, Ichinoe 등 (2)도 맥류로부터 유래된 사상균의 곰팡이독소 생성능을 조사한 결과, 분리된 Aspergillus flavus 58주중 15.5%에 해당되는 9주에서 aflatoxin이 검출되었다고 발표함으로써 맥류의 저장, 유통, 관리상에 문제점이 있음을 지적하였다.
niger와의 혼합배양으로 그 함량이 크게 줄어들었으며 P griseoj니의 혼합배양에서도 aflatoxin B, 생성이 줄어드는 결과를 볼 수 있었다. 또한 A. flavus, A. niger 및 P. griseojulvum%: 혼합 배양 시 12일째에는 93%가 감소하여 10.16㎍/ml의 aflatoxin 乌생성을 보였다.
또한 배양액의 pH 변화 및 산생성량을 조사한 결과 Fig.3과 Fig. 4에 나타난 바와 같이 pH는 A. nigere 같이 혼합배양한 군에서 pH가 대체로 낮고, 산생성량은 높게 나타나는 경향을 보였다. 그렇지만 A.
fiimigatusye 억제 효과를 가짐을 보고하였다. 본 연구의 결과에서도 서로 다른 곰팡이의 혼합배양으로 단독배양에서와는 달리 혼합배양 시 균 상호간의 경쟁작용과 다양한 대사산물의 생성으로 특정 곰팡이의 대사에 방해를 받으며 특히 곰팡이독소의 경우 생성이 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 또한 본 연구에서도 배양 중 산의 생성뿐만 아니라 다양한 성분이 있는 바, 곰팡이독소 생성을 억제할 수 있는 다른 요인들의 작용 가능성도 배제할 수 없다.
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