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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라 전통발효식품인 메주와 된장의 안전성 평가를 위하여 서부경남지역에서 시판되고 있는 메주와 된장시료를 구입한 다음 Aspergilluse 균을 분리하고 분리균의 aflatoxin 생성 여부를 본 연구실에서 확립한 면역 분석기법으로 조사하여 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- ELISA법에 의하여 AFB] 생성균주로 나타난 분리균 및 Aspergillus속으로 분리된 균을 TLC법으로 aflatoxin 생성 여부를 다시 확인하였다. 즉, 실험방법에서 설명한 바와 같이 분리균의 배양액을 ethyl acetate로 추출한 다음 추출액 1 ml을 농축한 후 200μl의 methanol에 재용해하여 TLC를 실시하였다.
- 각종 균원시료로부터 Aspergillus 속균을 분리하기 위해서 세균과 효모의 생육을 억제하고 곰팡이만 선택적으로 증식시키기 위하여 rose bengal이 35 mg/L 첨가된 rose bengal agar 배지를 사용하였으며, Aspergillus속 곰팡이의 순수분리 및 보관을 위해서 potato dextrose agar(PDA) 배지를 사용 하였고, 모든 배지는 멸균(121℃, 15 min)하여 사용하였다.
- 전개된 plate는 37℃에서 10분 정도 건조시킨 다음 IV(365 nm)하에서 표준 독소 AFB1, AFB2, AFG|, 및 AFG?와 비교 . 관찰하여 분리균의 aflatoxin 생성 유무를 재확인하였다.
- 반응하여 발색된 plate는 ELISA readei(Bio Rad Ins. USA; Model 550)로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 MPM soft- ware(Bio Rad, Version 4.0)를 사용하여 AFB함량을 계산하였다 23).
- 05% Tween80 멸균 증류수 9 ml가 함유된 시험관(18x200 mm)에 메주, 된장의 분쇄시료 1g을 넣고 10배, 100배, 1,000배, 10, 000배로 단계 희석한 혼합액 100μl를 표면을 건조시킨 각 4개의 rose bengal agar 평판배지에 도말한 후 28, C에서 4일간 배양하였다 '4). 배양 후 CFU를 측정하여 전체 곰팡이 오염도를 조사하였고, 형성된 colony의 모양, 크기 및 색깔 등을 육안과 현미경 관 찰을 통하여 Aspergillus 속으로 추정되는 균주를 선택하여 PDA 평판배지에서 분리를 반복하여 단일 colony를 순수 분 리하였다. 순수 분리한 Aspergillus 속 균주는 PDA 사면배 지에 접종하여 4℃에 보관하며 필요시 2회 계대(龍代) 배양한 후 이하의 실험에 사용하였다.
- 배지 위에 형성된 colony의 모양, 크기 및 색깔 등을 육안과 현미경 관찰을 통하여 표준 곰팡이와 비교해서 Aspergillus 속으로 추정되는 균주를 선택하여 PDA 평판배 지에 단일 colony를 분리하였다. 그 결과 Table 3 및 4에서와 같이 메주 및 된장에서 총 46개의 Aspergillus속 추정균주를 분리하였고, 메주에서 된장보다 약 2배 정도로 높은 Aspergillus속 균주 분리율을 보였다.
- 수집한 각종 메주와 된장 1 g을 멸균 0.05% Tween80 용액으로 단계희석 후 rose bengal agar 평판배지에 접종하여 28℃에서 4일간 배양 후 colony를 판별하였다. 그 결과 Table 3 및 Table 4에서 보는 바와 같이 수집된 메주 시료에 서의 평균 CFU는 3.
- 순수 분리한 Aspergillus 속 곰팡이는 sucrose low salts (SLS)배지에서 배양하여 aflatoxin 생성정도를 관찰하였다. 즉, SLS배지 9 ml에 분리균의 포자현탁액 100J11씩 접종한 후 25℃에서 15일간 배양하였다'39).
- ELISA법에 의하여 AFB] 생성균주로 나타난 분리균 및 Aspergillus속으로 분리된 균을 TLC법으로 aflatoxin 생성 여부를 다시 확인하였다. 즉, 실험방법에서 설명한 바와 같이 분리균의 배양액을 ethyl acetate로 추출한 다음 추출액 1 ml을 농축한 후 200μl의 methanol에 재용해하여 TLC를 실시하였다. 그 결과 ELISA 검사결과와 유사하게 독소생성 능이 낮거나 없는 균들은 특이 spot을 확인할 수 없었고, aflatoxin 생성능이 높은 균주들은 Fig.
- 순수 분리한 Aspergillus 속 곰팡이의 aflatoxin 생성 유무를 TLC 방법에 의해 재확인하였다. 즉, 표준독소 AFB1,AFB2, AFGp AFG2(Sigma Co, Louis, MO, USA)희석액 및 ethyl acetate로 추출한 배양액 1 ml을 건조 후 100% methanol 200 )11에 재용해한 시료액을 110℃에서 1시간 정도 활성화시킨 TLC plate(No.5553, Merck Co. Darmstadt, Germany)에 점적하였다. TLC plate는 CHCleMeOH (97: 3(v/v)) 혼합액을 전개용매로 1차 전개시키고 37℃에서 10분 정도 건조시킨 다음 다시 toluene:ethyl acetate:formic acid (5:4:l(v/v)) 혼합한 용매로 2차 전개시켰다.
대상 데이터
- 본 실험에 이용된 균원시료는 서부경남 9개 지역(함양, 사천, 진주, 하동, 곤양, 사천, 삼천포, 고성 및 마산)에서 각각 메주 10점 된장 20점을 무작위로 Table 1과 같이 구입하여 분쇄한 후 4℃에 보관하면서 Aspergillus속 곰팡이의 분리와 aflatoxin 생성균 검색에 사용하였다12.13)
- 분리한 Aspergilluse- 곰팡이 중 aflatoxin 생성균을 검색하기 위하여 본 실험실에서 확립한 direct competitive enzyme linked immunosorbent assay(DC-ELISA)를 실시하였다. 이때 사용한 항체는 Table 2에서 보는 바와 같이 aflatoxin BJAFB1)에 대해서는 100% 교차 반응성을 보이고 AFB2, AFG1, AFG2, toxin(Sigma Co, Louis, MO,USA)과는 각각 26, 61, 및 24% 정도 교차 반응성을 보이나 다른 곰팡이 독소 (ochratoxin, T-2 toxin, zearalenone) 와는 교차반응성이 없는 단클론성 항체 (AF-78 MAb)을 사용하였다.끄)
- 121℃ 에서 15분간 멸균한 뒤 영양균체 및 포자를 사멸시키고 균체를 제거한 다음 3 ml의 ethyl acetateS. 추출하여 유기용매 층 1 ml 씩을 취해 N2 gas로 농축하여 ELISA 및 TLC법에 의한 분리균의 독소생성능 측정을 위한 시료로 사용하였다202, 농축된 샘플은 10% MeOH/PBS 1 ml에 용해하여 ELISA검사용으로 사용하였으며 , 100% methanol 200 μl에 재용해하여 TLC용으로 사용하였다.
이론/모형
- 분리한 Aspergilluse- 곰팡이 중 aflatoxin 생성균을 검색하기 위하여 본 실험실에서 확립한 direct competitive enzyme linked immunosorbent assay(DC-ELISA)를 실시하였다. 이때 사용한 항체는 Table 2에서 보는 바와 같이 aflatoxin BJAFB1)에 대해서는 100% 교차 반응성을 보이고 AFB2, AFG1, AFG2, toxin(Sigma Co, Louis, MO,USA)과는 각각 26, 61, 및 24% 정도 교차 반응성을 보이나 다른 곰팡이 독소 (ochratoxin, T-2 toxin, zearalenone) 와는 교차반응성이 없는 단클론성 항체 (AF-78 MAb)을 사용하였다.
- 순수 분리한 Aspergillus 속 곰팡이의 aflatoxin 생성 유무를 TLC 방법에 의해 재확인하였다. 즉, 표준독소 AFB1,AFB2, AFGp AFG2(Sigma Co, Louis, MO, USA)희석액 및 ethyl acetate로 추출한 배양액 1 ml을 건조 후 100% methanol 200 )11에 재용해한 시료액을 110℃에서 1시간 정도 활성화시킨 TLC plate(No.
성능/효과
- 1X105 (CFU/ml)로 나타났다. CFU로 비교해볼 때는 메주와 된장에서의 곰팡이 발현 빈도는 큰 차이가 없었어나, 된장에서 곰팡이의 colony 수가 약간 많았다. 그러나 된장보다 메주에서 다양한 colony가 발견되어 메주에서 보다 많은 종류의 곰팡이가 혼재되어 있음을 알 수 있었다.
- DC-ELISA법으로 분리균 배양액 중의 aflatoxin을 정량한 결과, 분리균 M-5-4를 배양한 액체 배지에서 ml 당 aflatoxin 이 98.26 (ng/ml)로 가장 높게 검출되었으며, 분리균 M-2-1, M-2-2 및 M-4-1의 배양액에서도 aflatoxin이 각각 84.09, 76.98 및 50.74 ng/ml로 검출되었다. 된장에서 분리된 균의 경우는 aflatoxin 생성정도가 낮아 분리균 S-15-3은 17.
- 즉, 메주시료에서 분리한 24균주 중 25%인 6균주가 그리고, 된장에서 분리한 22균주 중 9%인 2균주가 aflatoxin을 생산하는 것으로 나타났다. 결과적으로 메주에서 aflatoxin 생성균주가 된장보다 약 3배에 가까운 수치로 발견되었으며, 이는 주변환경에서의 alfetoxin 생성균주의 오염가능성이 높음을 예측할 수 있다. 따라서 대규모 메주 및 된장 가공공장은 물론 최근 전국적으로 늘어나고 있는 소규모 전통발효식 품 제조공장에서의 유해곰팡이의 오염예 방과 규제가 각별히 요구된다.
- 즉, 실험방법에서 설명한 바와 같이 분리균의 배양액을 ethyl acetate로 추출한 다음 추출액 1 ml을 농축한 후 200μl의 methanol에 재용해하여 TLC를 실시하였다. 그 결과 ELISA 검사결과와 유사하게 독소생성 능이 낮거나 없는 균들은 특이 spot을 확인할 수 없었고, aflatoxin 생성능이 높은 균주들은 Fig. 1에서와 같이 AFB, 과 같은 #치를 가지는 푸른 형광성이 있는 spot을 확인할 수 있었다.
- 배지 위에 형성된 colony의 모양, 크기 및 색깔 등을 육안과 현미경 관찰을 통하여 표준 곰팡이와 비교해서 Aspergillus 속으로 추정되는 균주를 선택하여 PDA 평판배 지에 단일 colony를 분리하였다. 그 결과 Table 3 및 4에서와 같이 메주 및 된장에서 총 46개의 Aspergillus속 추정균주를 분리하였고, 메주에서 된장보다 약 2배 정도로 높은 Aspergillus속 균주 분리율을 보였다.
- 05% Tween80 용액으로 단계희석 후 rose bengal agar 평판배지에 접종하여 28℃에서 4일간 배양 후 colony를 판별하였다. 그 결과 Table 3 및 Table 4에서 보는 바와 같이 수집된 메주 시료에 서의 평균 CFU는 3.3 X 104 ±6.2X104 (CFU/ml) 이 었고, 된장시료의 평균 CFU는 5.0 X 104± 1.1X105 (CFU/ml)로 나타났다. CFU로 비교해볼 때는 메주와 된장에서의 곰팡이 발현 빈도는 큰 차이가 없었어나, 된장에서 곰팡이의 colony 수가 약간 많았다.
- CFU로 비교해볼 때는 메주와 된장에서의 곰팡이 발현 빈도는 큰 차이가 없었어나, 된장에서 곰팡이의 colony 수가 약간 많았다. 그러나 된장보다 메주에서 다양한 colony가 발견되어 메주에서 보다 많은 종류의 곰팡이가 혼재되어 있음을 알 수 있었다.
- 순수 분리한 Aspergillus 속 곰팡이를 sucrose low salts (SLS)배지에서 배양하여 aflatoxin 생성정도를 DC-ELISA법 으로 확인한 결과 Table 5에서와 같이 Aspergillus 속으로 분리한 46균주 중 17.4%인 8균주가 aflatoxin 생성균주로 확인되었다. 즉, 메주시료에서 분리한 24균주 중 25%인 6균주가 그리고, 된장에서 분리한 22균주 중 9%인 2균주가 aflatoxin을 생산하는 것으로 나타났다.
- 4%인 8균주가 aflatoxin 생성균주로 확인되었다. 즉, 메주시료에서 분리한 24균주 중 25%인 6균주가 그리고, 된장에서 분리한 22균주 중 9%인 2균주가 aflatoxin을 생산하는 것으로 나타났다. 결과적으로 메주에서 aflatoxin 생성균주가 된장보다 약 3배에 가까운 수치로 발견되었으며, 이는 주변환경에서의 alfetoxin 생성균주의 오염가능성이 높음을 예측할 수 있다.
- 한편, 배양액의 aflatoxin 정량에 앞서 표준 AFB1으로 DC-ELISA를 실시하여 회수율을 구한 결과 Table 6에서 보는 바와 같이 최저 86%에서 최고 105%로 나타나 DC- ELISA법에 의한 AFB, 정량결과를 신뢰할 수 있었다.
후속연구
- 저장시 메주 자체에 축적된 독소가 이행될 확률이 높다, 특히 된장의 경우는 독소생성균의 분리빈도는 낮지만, 바로 섭취하는 식품 자체의 특성상, 이행될 aflatoxin이 화학적 위 해요소로서 작용할 가능성이 크다. 그러나, Park 등2, 이 보고한 바와 같이 된장이나 간장의 발효과정 중 aflatoxin의 분해는 물론 aflatoxin의 독성을 저해하는 물질이 존재할 가능성이 있으므로 메주나 된장 등의 전통식품에 대한 지속적인 안전성 연구가 필요하다고 사료되는 바이다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 앞으로 메주나 된장에서 각 시료 자체에 생육하고 있는 곰팡이 중 aflatoxin의 생성여부 를 알아보는 것은 전통식품의 안전성확보를 위하고 국제경쟁력을 높이기 위해서 반드시 필요하다. 앞로는 메주나 된장을 생산하는 식품공장을 포함한 전통식품가공 공장에서 생산된 제품들의 국제화를 위해 무엇보다 이들 공장에서의HACCP(Hazard Analysis Critical Control Point) system의 적용이 필연적이다26).
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