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문제 정의
- 본 연구에서는 유효한 흡수촉진제와 ma血를 검색하고 피부투과성이 신속하고 생체이용률이 높으며 피부 자극성이 적은 KP의 matrix type patch를 사람 카다베르 피부에 부착하여 KP의 경피투과성을 시험함으로서 인체피부에 부착하였을 때의 경피투과 특성을 연구하고자 하였으며, 이를 위하여 각 패취의 skin permeatrion enhancer첨가 효과를 평가하고 각 formulation에서의 첨가 효과를 사람 카다베르 피부를 통한 skin flux로 확인 한 다음 이를 흰쥐를 대상으로 한 동물실험과 비교하였으며, 동물실험에서는 AUC, Cmax, T时를 구하여 생체이용률을 비교하였다.
제안 방법
- 사람 카다베르 피부를 통한 KP의 투과 - 흡수 촉진제로 triacetin 1%를 첨가하고 여기에 0%, 5%, 10%, 15%의 SMOt 함유하는 패취(辅, S5, S10, Sb), 0%, 2%, 4%, 8%의 PVP를 함유하는 패취(乌, P2)P4, P8), SMO와 PVP를 각각 10%, 8%씩 함유하고 HPC를 0%(S10P8), 1%(S"8+Hi), 2%(S1oP8+H2) 함유한 KP 패취로부터 KP가 사람 카다베르 피부를 투과하는 누적량을 시간의 함수로 나타낸 그래프에서 산출된 flux와 lag time은 Table II에 나타내었다.
- Pharmacokinetic Parameters의 산출 - 제작한 KP 패취를 이용한 in vivo 실험에서 KP의 약물속도론 적 파라미터로서 AUC為皿 및 Tg를 구하였다. AUC。一36M는 각 흰쥐의 혈장중 약물농도■시간 곡선으로부터 사다리꼴 공식으로 구하였고, 최고 혈중농도인 (3„剪와 최고혈중농도 도달시간 는 혈장중 약물농도-시간 곡선에서 직접 읽어 구하였다.
- 5°C이 유지되도록 하였으며 투과된 약물이 신속하게 혼합되도록 magnetic stirrer# 이용하여 일정한 속도를 유지하면서 교반하였다. Receptor phase로 방출되는 약물량을 일정 시간마다 0.1 m/씩 채취하여 GC/ MS로 분석하였다. 채취된 양은 즉시 같은 양의 인산염 완충액으로 보충하였다.
- 주입구의 온도는 280°C, transfer line의 온도는 250°C, electron multiplier는 1600V electron energy는 70 eV이었다. SIM mode 사용하기 위하여 메칠화된 KP 의 base ion인 209 m/z, 내부표준물질로는 메칠화된 flurbiprofen의 base ion인 199 m/z를 선택하여 각각의 유지시간대에서 이들 이온을 측정하여 함량시험을 실시하였다.
- AUC。一36M는 각 흰쥐의 혈장중 약물농도■시간 곡선으로부터 사다리꼴 공식으로 구하였고, 최고 혈중농도인 (3„剪와 최고혈중농도 도달시간 는 혈장중 약물농도-시간 곡선에서 직접 읽어 구하였다. 경피투여의 AUCojgto 弓皿 및 Tm宓에 대하여 Student's t-test 를 이용하여 유의성 검정을 하였다.
- Caruso 등⑸은 새로운 서방형 제제에 대한 생체이용률에 관한 연구를 실시하였고, Hagans은 KP의 지연방출성 송달법을 새로이 개발하려고 시도하였으며, Kamiya 등圮은 flurbiprofen, keto- profen, indomethacin 등 약물의 polyacrylic acid 수성 . 겔 제제를 제조하여 직장내 흡수의 실험을 시행하였다. 한편 KP의 전신성 부작용과 위장관 자극을 감소시키려는 시도로서 Saita 등18)은 겔 제제를 약물학적으로 시험하였고, Kyuki 등19)은 KP의 크림 제의 소염작용을 시험하였으며, Fujimura 등雄은 KP 연고제에 대한 약물학적 실험을 실시하였다.
- 투여방법으로는 하루 전날 털을 제거한 등 부위의 피부에 제작한 패취를 부착한 후 패취부분은 밖으로 노출될 수 있도록 청테이프에 구멍을 만든 후 테이프로 흰쥐의 몸통을 감아서 부착하는 방법으로 하여 패취가떨어지거나, 흰쥐에 의해서 손상 받는 것을 방지하였다. 경피 투여한 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24, 36시간 간격으로 눈에 있는 안정맥을 통해서 100 B 씩을 채혈하였다.
- 경피 흡수 실험 -체중 250~300g의 Sprague- Dawley계 흰쥐 5마리를 이용하여 경피투여할 때의 약물 동력학적 특성 및 생체이용률을 산출하기 위해서 제작한 KP 패취를 사용하여 흰쥐의 등 부위에 경피 투여하였다. 이때 사용한 흰쥐 등 부위의 털은 실험 하루 전날 제모기를 이용하여 털을 제거한 후 3% thioglycolic acid 크림을 이용하여 잔털을 제거하였다.
- 추출한 뒤 2, 300 rpm에서 10분간 원심분리하여 유기용매층을 취한 뒤 질소농축하였다. 농축된 잔사에 150 B의 aceton을 넣고 무수 K2CO3 50 mg, methyliodide 50 p/를 넣고 밀봉하여 60°C 진공 오븐에서 60분간 반응시킨 뒤 냉각하여 GC/MS 에 2 时씩 주입하여 분석하였다. GC/MS는 HP 5972 MSD를 사용하였으며 column은 HP-5MS fused silica capillary column(30 m XQ.
- 또한 PVP의 농도에 따른 투과영향을 알아보기 위해 PVP가 0, 2, 4, 8% 함유한 패취를 제조하였으며 HPC 1, 2% 함유된 패취로 제조하여 투과도를 비교하였다.
- 해동된 skin은 피부에 묻어 있는 glycerin을 제거하기 위해 2~S차례 milli-Q수로 세척하여 제거한 후 60°C의수욕상에 넣어 2~3분간 방치한 다음 꺼내 핀셋을이용하여 조심스럽게 표피층를 분리하였다. 분리된표피층은 확대경을 이용하여 손상된 부분을 확인하였다.
- 시험검체의 조성 -시험에 이용한 KP 패취의 조성은 Table I과 같이 control patch를 제조한 후 triacetin 의 함량을 1%로 하고 SMO 농도에 따른 투과도를알아보기 위해 SM0가 0, 5, 10, 15% 함유된 패취를제조하였다. 또한 PVP의 농도에 따른 투과영향을 알아보기 위해 PVP가 0, 2, 4, 8% 함유한 패취를 제조하였으며 HPC 1, 2% 함유된 패취로 제조하여 투과도를 비교하였다.
- 및 물은 충분히 공급하였다. 실험동물은 실험 하루 전에 절식 시켰고, 실험시 채혈을 위하여 에테르마취를 시킨 후 일정한 시간마다 안 정맥에서 채혈하였다. 채혈한 혈액은 원심분리기를 이용하여 4, 000 rpm에서 3분간 원심분리하여 혈장을 얻은 후, -70°C 에서 분석 시까지 보관하였다.
- 코팅 후 3-5분간 공기 중에서 용매를 휘발시킨 후 코팅판을 coating/ drying장치의 급/배기 시스템이 작동하는 오븐 안으로밀어 넣고 100°C에서 10분간 건조시키면서 점착제가 curing되도록 하였다. 완전히 건조된 코팅필름을 장치에서 풀어 낸 후 고정된 backing 丘Im과 밀착시킨 후로울러로 잘 문지르고, 코팅된 접착층이 backing film 으로 전사되었는지 확인하여 전사가 될 때까지 로울러로 잘 문질러 접착층을 전사시켰다. 이 때 backing film으로는 Scotchpak(3M, USA)을 사용하였다.
- 이때 사용한 흰쥐 등 부위의 털은 실험 하루 전날 제모기를 이용하여 털을 제거한 후 3% thioglycolic acid 크림을 이용하여 잔털을 제거하였다. 투여방법으로는 하루 전날 털을 제거한 등 부위의 피부에 제작한 패취를 부착한 후 패취부분은 밖으로 노출될 수 있도록 청테이프에 구멍을 만든 후 테이프로 흰쥐의 몸통을 감아서 부착하는 방법으로 하여 패취가떨어지거나, 흰쥐에 의해서 손상 받는 것을 방지하였다. 경피 투여한 후 0.
- 측정하였다. 혈액검체는 전처리하여 GC/ MS로 측정하여 적용 후 36시간까지 측정하였으며 본연구에 의해 얻어진 결론을 정리하면 다음과 같다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 초순수(저항218 Mohm・cmT)는 Millipore System(Milli-Q UF plus)을 이용해 실험실적으로 제조하여 사용하였다. 피부투과 실험에 이용한 Franz cell은 vertical type。.루 한국 화인(주)에서 제작한 것으로 receptor 부피는 5 ml, 투과면적은 0.636 cm2이며, water bath는 Brookfeld사의 TC 500을 사용하였다. 또한 혈청을 분리하기 위해서 원심분리기는한일과학산업(주)의 Micro 17TR을 사용하였으며, 교반기는 Thermolyne의 Maxi Mix II를 사용하였다.
- /-menthol, K2CO3, 수소화나트륨인산염 , 염화나트륨, 메탄올은 Junsei Chemical사로부터 구입하였다. 패취 제작시 사용한 acrylate 계 점착제는 DuroThkA로 National Starch사의 제품을 사용하였으며 hydroxypropyl cellulose(HPC), sorbitan monooleate (SMO)는 ICI사, polyvinyl pyrolidone(PVP)는 BASF 사의 제품을 사용하였다.
- 농축된 잔사에 150 B의 aceton을 넣고 무수 K2CO3 50 mg, methyliodide 50 p/를 넣고 밀봉하여 60°C 진공 오븐에서 60분간 반응시킨 뒤 냉각하여 GC/MS 에 2 时씩 주입하여 분석하였다. GC/MS는 HP 5972 MSD를 사용하였으며 column은 HP-5MS fused silica capillary column(30 m XQ.25 mm i.d. ().1 呻)을사용하였다. Carrier gas인 He의 유속은 0.
- 패취 제작시 사용한 acrylate 계 점착제는 DuroThkA로 National Starch사의 제품을 사용하였으며 hydroxypropyl cellulose(HPC), sorbitan monooleate (SMO)는 ICI사, polyvinyl pyrolidone(PVP)는 BASF 사의 제품을 사용하였다. Itiacetin은 Eastman사에서구입하였으며, GC/MS분석에 internal standard로 이용한 flurbiprofen은 삼일제약에서 공급받아 사용하였다. 기타 시약은 일급 또는 특급 시약을 사용하였다.
- 636 cm2이며, water bath는 Brookfeld사의 TC 500을 사용하였다. 또한 혈청을 분리하기 위해서 원심분리기는한일과학산업(주)의 Micro 17TR을 사용하였으며, 교반기는 Thermolyne의 Maxi Mix II를 사용하였다.
- 사람 카다베르 피부의 처리 -사람 카다베르 피부는 사망 한 사체에서 72시간이내 적출하여 글리세린으로 처리한 후 냉동 보관된 것을 IIAM(Inter- national Institute for the Advancement of Medicine, USA)에서 구입하여 -70°C 냉동고에 보관하였다. Franz cell을 이용한 투과도 실험을 실시하기 전에 skin을 꺼내 필요한 만큼의 크기로 자른 후 해동시키고 남은 skin은 다시 냉동 보관하였디.
- 시약 및 기기 -Ketoprofen은 Sigma에서 구입하여사용하였다. /-menthol, K2CO3, 수소화나트륨인산염 , 염화나트륨, 메탄올은 Junsei Chemical사로부터 구입하였다.
- 실험동물 및 채혈 - 체중 250~300 g의 Sprague- Dawley계 수컷 흰쥐를 실온 20±2°C로 유지되도록관리되는 중앙대학교 약학대학 실험 동물실에서 2주이상 사육하여 적응시킨 후 실험에 사용하였고, 고형사료 및 물은 충분히 공급하였다. 실험동물은 실험 하루 전에 절식 시켰고, 실험시 채혈을 위하여 에테르마취를 시킨 후 일정한 시간마다 안 정맥에서 채혈하였다.
- 기타 시약은 일급 또는 특급 시약을 사용하였다. 실험에 사용한 초순수(저항218 Mohm・cmT)는 Millipore System(Milli-Q UF plus)을 이용해 실험실적으로 제조하여 사용하였다. 피부투과 실험에 이용한 Franz cell은 vertical type。.
- /-menthol, K2CO3, 수소화나트륨인산염 , 염화나트륨, 메탄올은 Junsei Chemical사로부터 구입하였다. 패취 제작시 사용한 acrylate 계 점착제는 DuroThkA로 National Starch사의 제품을 사용하였으며 hydroxypropyl cellulose(HPC), sorbitan monooleate (SMO)는 ICI사, polyvinyl pyrolidone(PVP)는 BASF 사의 제품을 사용하였다. Itiacetin은 Eastman사에서구입하였으며, GC/MS분석에 internal standard로 이용한 flurbiprofen은 삼일제약에서 공급받아 사용하였다.
데이터처리
- AUC。一36M는 각 흰쥐의 혈장중 약물농도■시간 곡선으로부터 사다리꼴 공식으로 구하였고, 최고 혈중농도인 (3„剪와 최고혈중농도 도달시간 는 혈장중 약물농도-시간 곡선에서 직접 읽어 구하였다. 경피투여의 AUCojgto 弓皿 및 Tm宓에 대하여 Student's t-test 를 이용하여 유의성 검정을 하였다.
성능/효과
- KP의 GC/MS 정량 - 시료 및 혈장중의 정량은 100-1, 000 ng범위에서 검량선을 작성하였으며 상관계수의 값은 0.99이상이었고, in vitro 패취 투과액의 0.2-5 卜ig범위에서 검량선을 작성하였으며 상관계수의값은 0.99이상이었다.
- SM0함유 패취의 경우에는 SM0의 농도가 증가함에 따라 AUC와 AUMC의 값이 증가하여 약물의 흡수량과 생체이용률이 증대됨을 알 수 있었다. 이 결과는 SM0의 농도가 증가함에 따라 skin flux가 증가하는 경향을 갖는 것과 일치하는 결과로 피부로의 분배능력을 개선시킨 결과로 보여진다.
- 46 hr이었다. SMO 15%첨가는 패취의 skin flux를 가장 크게 증가시켰고 lag time을 지현시키는 효과가 가장 컸다. SMO는 점착제 기제 내에서의 약물의 용해도를 높이며 cu血g된 후에 기제 내에서의 약물의 거동을 좋게 하는 작용을 하는데 이 경우 약물의 피부에 대한 분배가 좋아지고 기제 내에서의 약물 거동이 개선됨에 따라 피부를 투과하는 능력이 증가한 것으로 보여진다.
- h/mZ로서 가장 크게 나타났다. 이 결과는 P4에서 KP의 생체이용율이 가장 컸으나 흡수지속시간은 가장 짧았다는 것을 시사한다 (Fig. 2).
- 이상의 결과로부터 1% triacetin, 4% PVB 15% 이상의 SMO, 1~2%의 HPC를 첨가하는 것이 flux 값이 크고 lag time값이 적은 우수한 KP패취제를 제조하는데 최적조성임을 확인하였다.
- 약 60%의 증가를 나타냈다. 특히 lag time에 있어서 80%정도의 단축을 보여 약물의 피부투과분배에 있어 유의성있는 효과를 나타냈으며, 이는 동물실험에서 5% SM0에 비해 15% SMO에서 3배 이상 증가하여 혈장 최고농도임을 확인하였다. 한편, PVP의 첨가는 skin flux를 감소시켰으며 이는 PVP의 상호작용에 의한 방출지연으로 이는 HPC의첨가로 개선되었다.
- 흡수촉진제로 1%의 triacetin을 첨가후 SM0의 첨가는 농도가 증가할수록 skin flux가 증가하였으며, 15%에서는 약 60%의 증가를 나타냈다. 특히 lag time에 있어서 80%정도의 단축을 보여 약물의 피부투과분배에 있어 유의성있는 효과를 나타냈으며, 이는 동물실험에서 5% SM0에 비해 15% SMO에서 3배 이상 증가하여 혈장 최고농도임을 확인하였다.
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