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문제 정의
- 따라서 본 연구는 한국산 겨우살이 추출물의 임상 적응용 가능성을 전제로 lectin에 정량적 분석법의 개발을 확립하고자 KML-C에 대한 단일 크론 항체를 생산하고, 항체의 특성연구를 일부 실시하였으며, 그 결과에 근거하여 KMLC의 정량을 위한 sandwich ELISA 법을 확립하고자 실시하였다.
- 7, 8丄) 따라서 이미 보고된 바와 같이 한국산 겨우살이 추출물에서 지표물질로서 선정 가능성이 가능 높은 lectin 성분인 KML-C* 정량법 개발은 앞으로의연구진행 방향과 더불어 중요한 의의를 가지는 것으로사료되는 바이다. 본 연구는 정량법 개발을 위하여 KML-C에 대한 단일 크론 항체를 생산하고, 생산된 항체의 특성조사를 실시 후, KMLC에 특이적인 혹은유럽산 겨우살이 lectin인 MI兑과 교차반응을 나타내는 항체를 이용하여 한국산 겨우살이 추출물중의 lectin 함량을 측정하기 위한 sandwich ELISA법을 개발에 관한 것이다.
- 알려져 있다. 본 연구에서 KML-C의 면역분석법 확립을 위하여 단일 크론 항체를 생산하였고, 항체의 특성을 조사하였다. ELISA법에 의한 단일 크론 항체의 특성을 조사한 결과 특이성 면에서 크게 두 가지의 특성을 나타내었다.
제안 방법
- 약술하면, KMLC을 면역한 Balb/c 마우스의 비장세포와 P3U1 골수종을 PEG를 이용하여 융합 후, HAT 배지로 배양하면서 hybHdoma를 선별하고, KML-C에 대한항체를 생산하는 hybridoma 세포를 선택 후, 96 well plate에서 well 당 1개의 hybridoma 가 되도록 분주(cloning)하고 colony를 형성하며 성장할 때까지 배양하였다. Colony를 형성한 hybridoma 의 배양 상등액을 ELISA로 측정하여 KML>C에 대한 항체를 생산하는 hybridoma를 선별(screening) 하였으며, 이러한 cloning과 screening를 1회 더 반복하여 KML-C에 대한 단일 크론 항체를 생산하는 hybridoma 세포를 선택하였다.
- 분리된 항체에 HRP의 결합은 상법 (Periodate coupling method)에 의하여 수행하였다. ELISA를 위한 HRP-conjugate의 농도를 결정하기 위하여 KML-C를 2 Hg/well이 되도록 coating하고 여러 농도로 조정된 HRP-conjugate를 반응 후 OD치를 측정하였다.
- ELISA에 의한 단일 크론 항체의 특성 및 역가의 조사-KML-C에 대한 단일 크론 항체의 대량생산을 위하여 KML-C와 높은 반응성을 나타내는 융합세포를 마우스 복강에 주사하여 얻은 복수의 titer 및 항체의 교차반응에 대한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 항체의 역가 측정을 위한 ELISA법은 血ect법으로서 KML-C혹은 ML-1을 plate의 각 well에 coating하고 2배 희석법으로 희석된 항체와 반응 후 나타난 O.
- 재현성 실험은동일한 표준곡선 하에서 미리 지정한 농도의 KML-C 를 적용 후 표준곡선 하에서의 KML-C 농도를 측정한 intra assay와 동일한 농도를 시간을 달리하여 측정 후 그 오차를 조사한 inter assay의 두 가지를 실시하였다(Eble H, ID). Intra assay는 KML-C 정량을위한 범위인 2000 ng에서 20 ng/m/에서 임의적으로비교적 높은 농도인 1000 ng/m/, 중간 농도인 200 ng/ml, 그리고 비교적 낮은 농도인 40 ng/mZ의 3가지농도를 정하였다. 분석을 위한 각 농도별 시료는 각각 20개씩 측정하였고 KML-C 정량을 위한 표준곡선에적용하여 나온 결과를 Table Ⅱ에 제시하였다.
- 8%를 보임으로 서 비교적 우수한 결과를 나타냈다. KML-C에 대한 재현성 실험으로서 동일한 농도에 대하여 시간을 달리하여 측정한 inter assay는 총 7회에 걸쳐서 측정하였다. 실험에 적용한 KML(의 측정농도는 intra assay와 동일한 농도로 조사하였다.
- KML-C에 대한 표준곡선 작성을 위한 두 번째 방법으로 IgGl type 항체간의 조합을 위한 실험을 실시하였다. 9H10-D1 항체를 coating 후 8B11-2C5-HRP로검색한 결과 KML-C의 한계검출농도는 약 150 ng/ m2이었고, 8B11-2C5 항체를 coating 후 9H7-D10-HRP에 의한 assay결과 KMLC의 한계 검출농도는약 40 ng/血로 나타났다(Fig.
- KMLC에 대한 mAb의 생산-융합세포 9H7, 8B11, 5E10, 8E11 등이 분비하는 상등액은 ELISA 에 의한 항체생성 여부의 조사 결과, KML-C와 높은반응성을 보였기에 단일 크론 항체의 생산을 위한 2차 cloning을 실시하였다. 그 중 양성반응을 나타내는 subclones의 배양상 등액을 이용하여 항체의 특성을 조사하였다(Eble I).
- Lectin 정량을 위한 Two-site sandwitch ELISA -KML-C에 대한 표준곡선을 작성하기 위하여 우선 coating Ab와 HRPconjugate의 조합 관계를 조사하였다. 이 실험을 위하여 우선 IgM 句pe의 두 가지 항체 (8E12-3E9, 5E10-F1)를 coating 한 毛 여러농도의 KML-C를 넣고, 9H7-D10-HRP 및 8B11-2C5-HRP 를 반응시킨 후 얻어진 표준 곡선을 Fig.
- 항체였다. Sandwich ELISA를 위한 HRP-conjugate의 농도를 결정하기 위하여 우선 ELISA plate의 각 well에 KMLC를 coating하고 HRPvonjugate를 여러 농도로 조정하여 반응시킨 후 OD 값을 측정하여 Fig. 2와 같은 결과를 얻었다. 그결과 9H7-D10-HRP의 경우는 약 200師배 희석액부터, 8B11-2C5-HRP의 경우는 약 5000배부터 OD 값이떨어지기 시작하였다.
- 앞으로 KM LC에 대한 단일 크론 항체와 반응하는 각 chain의 동정은 중요한 의미를 가진다 하겠다. lonevitsky AG 등(4)이유럽산 겨우살이 lecin의 분석을 위하여 생산한 단일크론 항체는 ML-I의 A-chain 혹은 ML-UI를 면역하여 얻은 것으로서 다음과 같이 ML-I 및 ML4I의 Achain 특이적인 것, ML-U 및 ML-UI의 A-chain 특이적인 것, ML-I, -Ⅱ, -UI의 A-chain 특이적인 것 등 3 가지 형태의 항체로 분류하였다. 즉 ML-Ⅲ의 A-chain 은 ML-I 혹은 ML-U의 A-chain과 교차반응을 하고 ML-I과 ML-Ⅱ의 A-chain 각각에 대하여는 특이성을 가지는 항체가 생산되었다는 것을 의미하는 것이다.
- 겨우살이 lectinS] 면역-(주)대한 바이오링크에서구입한 6주령의 자성 Balb/c 마우스에 PBS에 용해된 20 ng/100 叫의 KML-C에 동량의 FCA를 유화시켜복강에 면역시켰다. 14일 후에 동량의 항원을 FIA에유화시켜 1회 더 면역시켰다.
- 겨우살이로부터 lectin의 분리 -KM-110으로부터 lectin성분의 분리는 유럽산 겨우살이로부터 lectin을분리한 hydrolyzed sepharose-4B column을 이용하는 chromatography 방법을 일부 수정하여 실시하였다. 약술하면, 수용액상의 한국산 겨우살이 추출물(0M-11O) 에 ammonium sulphate(70%)를 가하여 단백질 분획을 침전시킨 후 PBS 용액에 대하여 투석하였다.
- 실시하였다. 그 중 양성반응을 나타내는 subclones의 배양상 등액을 이용하여 항체의 특성을 조사하였다(Eble I). 결과에 나타낸 바와 같이 9H7 subclones는 KMLC와 특이적인 반응성을 나타내었고, 8B11, 5E10, 8E12 subclones는 EML-1 과의 교차반응을 나타내었으며 항체의 sub-isotype을 조사한 바, 9H7 및 8B11 등의 subclones는 IgGl class 였고, 5E10 및 8E12은 IgM을 나타내었다.
- 단일 크론 항체의 분리 및 HRP의 conjugation 및 적용 농도의 결정 - 항체의 대량생산은 pristme을 주입한 마우스의 복강에 9H7-D10 8B11-2C5 hybridoma 세포를 주사하여 ascitic fluid(복수)를 얻었으며, 항체의 정제를 위하여 북*'를 protein-G affinity column (Phamacia, USA)에 적용하여 항체를 분리하였다. 분리된 항체에 HRP의 결합은 상법 (Periodate coupling method)에 의하여 수행하였다.
- 따라서 이 표준곡선에 이용하여 KML-C의 분석을 위한 재현성 실험을 실시하였다. 재현성 실험은동일한 표준곡선 하에서 미리 지정한 농도의 KML-C 를 적용 후 표준곡선 하에서의 KML-C 농도를 측정한 intra assay와 동일한 농도를 시간을 달리하여 측정 후 그 오차를 조사한 inter assay의 두 가지를 실시하였다(Eble H, ID).
- inter assay를 실시하였다. 반복 실험 후 본 assay system의 반복성 정도는 각 농도에 대한 실험결과에 대한 C.V(co函cient variation)을 산출함으로 결정하였다. 회수율 조사는 PBS에 각각 40, 200, 1000 ng同로 KML-C를 첨가 후 assay 결과 얻은 KML-C의 함량을 조사 후, 첨가농도에 대한 bias(%)로 표시하였다.
- 반복성 및 회수율 조사-본 assay system의 반복성 정도(reproducibility)를 평가하기 위하여 시료중 KML-C의 농도가 높은 것, 중간 것 및 낮은 것의 3개로구분하여 한 시료당 20회씩 반복 측정하여 intra assay 를 실시하였고, 7회의 다른 시간에 동일한 실험을 실시하여 inter assay를 실시하였다. 반복 실험 후 본 assay system의 반복성 정도는 각 농도에 대한 실험결과에 대한 C.
- KML-C에 대한 재현성 실험으로서 동일한 농도에 대하여 시간을 달리하여 측정한 inter assay는 총 7회에 걸쳐서 측정하였다. 실험에 적용한 KML(의 측정농도는 intra assay와 동일한 농도로 조사하였다. 그 결과 CV값은 실험에 적용한 농도인 1000, 200, 40 ng/ml 모두에서 10% 이내로 나타났고, bias의 경우 1000 ng/mZ 및 200 ng/mZ의 경우에서는 +bias를 40 ngW의 농도에서는 -bias를 나타냈으나 평균+0.
- 약술하면, 수용액상의 한국산 겨우살이 추출물(0M-11O) 에 ammonium sulphate(70%)를 가하여 단백질 분획을 침전시킨 후 PBS 용액에 대하여 투석하였다. 이용액을 hydrolyzed sepharose 4B column(1.
- 그결과 9H7-D10-HRP의 경우는 약 200師배 희석액부터, 8B11-2C5-HRP의 경우는 약 5000배부터 OD 값이떨어지기 시작하였다. 이 결과는 충분한 양의 항원 존재시 항원에 대한 HRP-conjugate의 최고 반응성이 위에 제시한 농도까지는 최소한 유지되는 것을 의미함으로 표준 곡선 작성을 위한 9H7-D10-HRP 및 8B11-2C5-HRP의 희석농도는 각각 2000배 및 5000배로결정하였다.
- 이 실험을 위하여 우선 IgM 句pe의 두 가지 항체 (8E12-3E9, 5E10-F1)를 coating 한 毛 여러농도의 KML-C를 넣고, 9H7-D10-HRP 및 8B11-2C5-HRP 를 반응시킨 후 얻어진 표준 곡선을 Fig. 3에 제시하였다. 그 결과 IgM type의 항체는 두 HRP-conjugate 와 좋은 조합 관계를 나타냈다.
- 따라서 이 표준곡선에 이용하여 KML-C의 분석을 위한 재현성 실험을 실시하였다. 재현성 실험은동일한 표준곡선 하에서 미리 지정한 농도의 KML-C 를 적용 후 표준곡선 하에서의 KML-C 농도를 측정한 intra assay와 동일한 농도를 시간을 달리하여 측정 후 그 오차를 조사한 inter assay의 두 가지를 실시하였다(Eble H, ID). Intra assay는 KML-C 정량을위한 범위인 2000 ng에서 20 ng/m/에서 임의적으로비교적 높은 농도인 1000 ng/m/, 중간 농도인 200 ng/ml, 그리고 비교적 낮은 농도인 40 ng/mZ의 3가지농도를 정하였다.
- 14일 후에 동량의 항원을 FIA에유화시켜 1회 더 면역시켰다. 최종 면역 10일 후에마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청을 얻은 후, ELISA로 항체의 역가를 확인하였다. 항체의 역가 확인 후에 adjuvant 없이 20 ng의 항원만으로 복강내에 booster injection하였으며, 최종 면역 1주일 후에 마우스를 희생시켜 단일 크론 항체의 생산을 위하여 비장을취하였다.
- 최종 면역 10일 후에마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청을 얻은 후, ELISA로 항체의 역가를 확인하였다. 항체의 역가 확인 후에 adjuvant 없이 20 ng의 항원만으로 복강내에 booster injection하였으며, 최종 면역 1주일 후에 마우스를 희생시켜 단일 크론 항체의 생산을 위하여 비장을취하였다.
- V(co函cient variation)을 산출함으로 결정하였다. 회수율 조사는 PBS에 각각 40, 200, 1000 ng同로 KML-C를 첨가 후 assay 결과 얻은 KML-C의 함량을 조사 후, 첨가농도에 대한 bias(%)로 표시하였다.
대상 데이터
- 3 - Comparision on dose response curve of KML-C measured by sandwich ELISA coated with IgM type mAbs. The wells were coated with 5E10-F1 or 8E12-3E9. After incubation with KML-C, two types of conjugates, 9H7-D10-HRP or 8B11-2C5-HRB were added each well.
- mAb-HRP2| 농도결정 - 본 실험의 ELISA에 적용하기 위한 HRP를 접합시킨 항체(HRP-conjugate)는한국산 겨우살이 lectin에만 특이적으로 반응하는 9H7-D10과 유럽산 겨우살이 lectin과 교차반응을 나타타내는 8BU-2C5 항체였다. Sandwich ELISA를 위한 HRP-conjugate의 농도를 결정하기 위하여 우선 ELISA plate의 각 well에 KMLC를 coating하고 HRPvonjugate를 여러 농도로 조정하여 반응시킨 후 OD 값을 측정하여 Fig.
- ELISA plate의 각 well에 2 网同의 농도로 조정된 KML-C를 100 B씩 coating하고 양성 반응을 나타내는 hybridoma의복수를 넣고 반응 후, 마우스 면역글로부린의 각 isotype에 대하여 특이적인 2차항체 (peroxidaseYonju-gated goat anti mouse IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 혹은 IgM)t 이용하는 ELISA 법으로 항체의 subisotype을 결정하였다. 발색을 위하여 기질로서 ABTS[0.2 mM of 2, 2-azino-di-(3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid) diammonium salt, Kirkegaard and Perry Laboratory Inc., Gaithersburg, MD] 를 이용하였고, 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 단일크론 항체의 역가는 흡광도 값이 0.
- 실험 재료 -Bovine Serum albumin(BSA)과 유럽산겨우살이 lectin-l(ML1)은 Sigm財(USA)사에서, Freund's complete adjuvant(FCA) 와 Freund's incomplete adjuvant(FIA)^ Difco(USA)에서, RPMI-1640 medium 과 fetal bovine serim(FBS) 는 Gibco(Grand Island NY)에서, Horse radish peroxidase(HRP) cojugated goat 혹은 rabbit anti-mouse IgG+A+M, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM 은 ZymedT, ab(USA) 에서구입하였다.
이론/모형
- ELISA법에 의하여 수행하였다. ELISA plate의 각 well에 2 网同의 농도로 조정된 KML-C를 100 B씩 coating하고 양성 반응을 나타내는 hybridoma의복수를 넣고 반응 후, 마우스 면역글로부린의 각 isotype에 대하여 특이적인 2차항체 (peroxidaseYonju-gated goat anti mouse IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 혹은 IgM)t 이용하는 ELISA 법으로 항체의 subisotype을 결정하였다. 발색을 위하여 기질로서 ABTS[0.
- ELISA-KWL-C의 표준 곡선을 얻기 위한 :SLISA는 sandwich법으로 수행하였다. 약술하면, KML-C에 대한 단일 크론 항체를 coating(10 하고위와 동일한 방법에 의하여 washing하였다.
- 단일 크론 항체의 생산- 기 발표된 방법 2)에 준하여 생산하였다. 약술하면, KMLC을 면역한 Balb/c 마우스의 비장세포와 P3U1 골수종을 PEG를 이용하여 융합 후, HAT 배지로 배양하면서 hybHdoma를 선별하고, KML-C에 대한항체를 생산하는 hybridoma 세포를 선택 후, 96 well plate에서 well 당 1개의 hybridoma 가 되도록 분주(cloning)하고 colony를 형성하며 성장할 때까지 배양하였다.
- 분리된 항체에 HRP의 결합은 상법 (Periodate coupling method)에 의하여 수행하였다. ELISA를 위한 HRP-conjugate의 농도를 결정하기 위하여 KML-C를 2 Hg/well이 되도록 coating하고 여러 농도로 조정된 HRP-conjugate를 반응 후 OD치를 측정하였다.
- 항체 역가의 측정-항체의 역가측정은 위하여 direct ELISA법에 의하여 수행하였다. ELISA plate의 각 well에 2 网同의 농도로 조정된 KML-C를 100 B씩 coating하고 양성 반응을 나타내는 hybridoma의복수를 넣고 반응 후, 마우스 면역글로부린의 각 isotype에 대하여 특이적인 2차항체 (peroxidaseYonju-gated goat anti mouse IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 혹은 IgM)t 이용하는 ELISA 법으로 항체의 subisotype을 결정하였다.
- 1에 나타내었다. 항체의 역가 측정을 위한 ELISA법은 血ect법으로서 KML-C혹은 ML-1을 plate의 각 well에 coating하고 2배 희석법으로 희석된 항체와 반응 후 나타난 O.D.값을 이용하여 결정하였다. 결과에 나타난 바와 같이 9H7-D10은 KML-C 특이적으로 반응하는 항체로 판명되었고, 8B11-2C5의 경우는 유럽산 겨우살이 lectin인 ML-1 과 높은 교차반응성을 나타내었다.
성능/효과
- 當) 겨우 살이 13血 성분은 숙주나무, 채취 시기, 추출방법에 따라 그 함량 차이가 있는 것으로 보고되고있고, 따라서 겨우살이 추출물의 임상적 이용에 관하여 일부 다른 문헌에서는 그 적용에 대하여 의문을 제기하기도 하였다.8) 한국산 겨우살이에 대한 연구도 최근에 활발히 진행되어 본 연구실에서는 한국산 겨우살이 추출물의 항종양, 면역증강 활성을 보고하였고그 주요 활성물질로서의 한국산 특이성을 가지는 lectin 성분(KML-C)을 분리하였다.")유럽산 겨우살이로부터의 lectin에 대한 연구 결과를 고찰하면 이들은 3 개의 isoform을 가지는 당 단백질로서 각 lectine 두개의 subch面n이 disulfide 결합을 한 형태로서 각각의 chaine 완전히 다른 기능을 가지는 것으로 보고되고있다.
- 9H10-D1 항체를 coating 후 8B11-2C5-HRP로검색한 결과 KML-C의 한계검출농도는 약 150 ng/ m2이었고, 8B11-2C5 항체를 coating 후 9H7-D10-HRP에 의한 assay결과 KMLC의 한계 검출농도는약 40 ng/血로 나타났다(Fig. 4).
- 결과에 나타난 바와 같이 9H7-D10은 KML-C 특이적으로 반응하는 항체로 판명되었고, 8B11-2C5의 경우는 유럽산 겨우살이 lectin인 ML-1 과 높은 교차반응성을 나타내었다. KML-C에 대한 각 복수의 힝체역 가는 ELISA에서 0D 값이 NSB(non-specific binding)보다 현저히 높은 0D 값, 즉 0.5 이상을 나타내는 복수의 희석치를 역가(titer)로 나타낼 때, IgGl type 의 항체인 9H7-D10은 KML-C 에 대하여 약 20만, ML河과는 교차 반응이 전혀 인정되지 않았고, 8B11-2C5의 경우는 각각 약 15만 및 21만 정도로 나타났다. 반면 IgM type의 항체인 8E12-3E9 및 5E10-F1 은 ML-1에 대한 반응성이 KMLC에 비하여 약간 높은 경향을 보였으며 항체 역가는 각가 약 4000 및 7000 정도를 나타냈다.
- KMLC에 대한 여러 단일 크론 항체 중 IgGl type의 9H7-D1Oe KMLC에 특이적으로 반응하였고, 8B11-2C5 항체는 유럽산의 ML-I과도 높은 교차빈 응을 나타냈다. 반면 IgM type의 5E10-F1과 8E12-3E9 등의 항체는 KML-C과 ML-I과 높은 교차반응을 나타냈다.
- 즉, 9H7-D10과 3C2-1H4 항체는 KML-C에만 특이적으로 반응하였고, 8B11-2C5, 8E12-3E9 및 5E10-F1항체는 ML-1 과도 강한 교차반응을 나타내었다. 각 항체의 subisotype을 조사한 결과 9H7-1D10, 3C2-1H4 and 8B11-2C5 는 IgGl type이었고, 8E12-3E9과 5E10-F1는 IgM type이었다. Sandwich ELISA법에 기초한 KNLC의 정량법을 확립하기 위하여 항체의 coating 및 검출에서 여러 항체 간의 조합 관계를 조사한 결과, 8E12-3E9 항체를 coating하고, 8B11-2C5-HRP 항체를 표지물질로 이용한 경우가 가장 높은 감도를 나타내었다.
- 값을 이용하여 결정하였다. 결과에 나타난 바와 같이 9H7-D10은 KML-C 특이적으로 반응하는 항체로 판명되었고, 8B11-2C5의 경우는 유럽산 겨우살이 lectin인 ML-1 과 높은 교차반응성을 나타내었다. KML-C에 대한 각 복수의 힝체역 가는 ELISA에서 0D 값이 NSB(non-specific binding)보다 현저히 높은 0D 값, 즉 0.
- 그 중 양성반응을 나타내는 subclones의 배양상 등액을 이용하여 항체의 특성을 조사하였다(Eble I). 결과에 나타낸 바와 같이 9H7 subclones는 KMLC와 특이적인 반응성을 나타내었고, 8B11, 5E10, 8E12 subclones는 EML-1 과의 교차반응을 나타내었으며 항체의 sub-isotype을 조사한 바, 9H7 및 8B11 등의 subclones는 IgGl class 였고, 5E10 및 8E12은 IgM을 나타내었다.
- 실험에 적용한 KML(의 측정농도는 intra assay와 동일한 농도로 조사하였다. 그 결과 CV값은 실험에 적용한 농도인 1000, 200, 40 ng/ml 모두에서 10% 이내로 나타났고, bias의 경우 1000 ng/mZ 및 200 ng/mZ의 경우에서는 +bias를 40 ngW의 농도에서는 -bias를 나타냈으나 평균+0.1 의 bias를 나타냄으로서 반복 성 실험에서 양호한 결과를 얻었다(Eble HI).
- 3에 제시하였다. 그 결과 IgM type의 항체는 두 HRP-conjugate 와 좋은 조합 관계를 나타냈다. 한국산 겨우살이 특이성을 가지는 9H7-D10항체에 의한 KML-C의 한계 측정범위는 5E1OF1의 coating 결과 70 ng/m/이었고, 8E12-3E9항체의 coathig 결과 40 ng/mZ까지의 감도를 보였다.
- 즉 ML-Ⅲ의 A-chain 은 ML-I 혹은 ML-U의 A-chain과 교차반응을 하고 ML-I과 ML-Ⅱ의 A-chain 각각에 대하여는 특이성을 가지는 항체가 생산되었다는 것을 의미하는 것이다. 그러나 본 연구의 KMLt를 구성하는 lectin인 KML-HU 및 KML-ULe 유럽산의 ML-I, -II 및 -HI와 현재까지의 연구결과로는 다른 것으로 보여 직접 비교는 불가능하지만 단지 8B11-2C5 항체가 ML4과 반응함으로서 KML-C를 구성하는 두 lectin 성분 중의 하나가 ML-I과 같거나 매우 유사한 구조의 항원 결정기를 가지고 있음을 강하게 암시하였다. KML-C의 당 특이성이 galactose 및 N-acethylg2dactosamine으로 ML-II와 동일한 당 특이성을 가진다 하더라도 현재까지의 연구 결과로 KML-C중 9H7-D104 반응하는 lectin 성분이 ML-II가 가지는 항원 결정기와 같거나 매우 유■사한 구조를 가진다는 것은 인정되나1侦7两) 전체 구조적으로 동일한 물질이라고는 단정할 수 없었다.
- 반면 IgM type의 5E10-F1과 8E12-3E9 등의 항체는 KML-C과 ML-I과 높은 교차반응을 나타냈다. 따라서 본 실험에서 생산한 항체의 특성을 요약하면 첫째, 한국산 겨우살이에만 특이적으로 반응하는 항처), 둘째, 유럽산 겨우살이 lectin과 교차반응을 나타내는 항체로 크게 두 가지 종류로 나눌 수가 있었다. 9H7-D10 항체가 KMLC에만 특이적으로 반응한다는 것은 KML-C는 유럽산 lectinQl ML-I과는 완전히 다른 항원 결정기(epitope)를 가진다는 것을 의미하였다.
- 9H7-D10 항체가 KMLC에만 특이적으로 반응한다는 것은 KML-C는 유럽산 lectinQl ML-I과는 완전히 다른 항원 결정기(epitope)를 가진다는 것을 의미하였다. 또한 8B11-2C5 항체의 경우 ML-I 및 KML-C와의 반응성이 유사하였는데 이는 KML-C는 동시에 ML-I 이 가지는 동일한 항원 결정기가 존재한다는 것을 증명하는 결과로 생각되었다. 이 전의 연구에서 KML-C는 유럽산 겨우살이 lectin 중의 하나인 ML-1과의 당 특이성, 분자량 및 등 전점에서 차이가 있는 다른 물질임이 밝혀졌다.
- 반복성 및 회수율(Reproducibility) 조사 - Coating Ab와 detection Ab의 여러 조합에 의하여 KNLC에대한 표준곡선을 작성한 결과 IgM type의 8E12-3E9 를 coating하고 IgGl type의 8B11-2C5-HRP로 검사한 sandwich ELISA assay가 가장 우수한 감도를 나타냈다. 따라서 이 표준곡선에 이용하여 KML-C의 분석을 위한 재현성 실험을 실시하였다.
- 본 실험에서의 sandwich ELISA에 의한 한국산 겨우살이 정량법의 정확성 및 반복 성 실험으로 intra, inter assay를 실시한 결과 CV값은 모두 10% 이내에있고 bias도 intra assay의 경우 2.0% 이내로 나타났다. 그리고 inter assay의 경우 3.
- 분석을 위한 각 농도별 시료는 각각 20개씩 측정하였고 KML-C 정량을 위한 표준곡선에적용하여 나온 결과를 Table Ⅱ에 제시하였다. 세가지농도의 KML-C에 대한 intra assay 결과 CV 값은4.59에서 5.83%로 10% 이내에 들었고, bias도 평균 0.8%를 보임으로 서 비교적 우수한 결과를 나타냈다. KML-C에 대한 재현성 실험으로서 동일한 농도에 대하여 시간을 달리하여 측정한 inter assay는 총 7회에 걸쳐서 측정하였다.
- Sandwich ELISA법에 기초한 KNLC의 정량법을 확립하기 위하여 항체의 coating 및 검출에서 여러 항체 간의 조합 관계를 조사한 결과, 8E12-3E9 항체를 coating하고, 8B11-2C5-HRP 항체를 표지물질로 이용한 경우가 가장 높은 감도를 나타내었다. 이 방법에 의하여 KML-C에 대한 표준곡선을 작성한 결과 검출한계는 7 ng/m/이었고, 검출 범위는 7-5,000 ng/mZ 수준이었다. 확립한 ELISA의 반복성 및 정확성을 CV 값으로 조사한 결과 inter assay의 경우는 3.
- ELISA법에 의한 단일 크론 항체의 특성을 조사한 결과 특이성 면에서 크게 두 가지의 특성을 나타내었다. 즉, 9H7-D10과 3C2-1H4 항체는 KML-C에만 특이적으로 반응하였고, 8B11-2C5, 8E12-3E9 및 5E10-F1항체는 ML-1 과도 강한 교차반응을 나타내었다. 각 항체의 subisotype을 조사한 결과 9H7-1D10, 3C2-1H4 and 8B11-2C5 는 IgGl type이었고, 8E12-3E9과 5E10-F1는 IgM type이었다.
- 그 결과 IgM type의 항체는 두 HRP-conjugate 와 좋은 조합 관계를 나타냈다. 한국산 겨우살이 특이성을 가지는 9H7-D10항체에 의한 KML-C의 한계 측정범위는 5E1OF1의 coating 결과 70 ng/m/이었고, 8E12-3E9항체의 coathig 결과 40 ng/mZ까지의 감도를 보였다. 한편, 8B1L2C5-HRP에 의한 표준 곡선의 작성 결과 5E10-F1의 coating 결과 20 n以mZ이었고, 8E12-3E9 항체의 coating 결과 7 n以m/의 감도를 나타냄으로, 두 경우 모두 8E12-3E9항체 coating 결과가 감도면에서 우수한 결과를 나타냈다.
- 한국산 겨우살이 특이성을 가지는 9H7-D10항체에 의한 KML-C의 한계 측정범위는 5E1OF1의 coating 결과 70 ng/m/이었고, 8E12-3E9항체의 coathig 결과 40 ng/mZ까지의 감도를 보였다. 한편, 8B1L2C5-HRP에 의한 표준 곡선의 작성 결과 5E10-F1의 coating 결과 20 n以mZ이었고, 8E12-3E9 항체의 coating 결과 7 n以m/의 감도를 나타냄으로, 두 경우 모두 8E12-3E9항체 coating 결과가 감도면에서 우수한 결과를 나타냈다.
- 이 방법에 의하여 KML-C에 대한 표준곡선을 작성한 결과 검출한계는 7 ng/m/이었고, 검출 범위는 7-5,000 ng/mZ 수준이었다. 확립한 ELISA의 반복성 및 정확성을 CV 값으로 조사한 결과 inter assay의 경우는 3.9~9.3, intra assay의 경우는 4.59~5.83으로 높은 재연성을 보임으로서, 본 연구에 얻은 sandwich ELISA법은 우수한 정량법으로 인정되었다.
후속연구
- KML-C의 당 특이성이 galactose 및 N-acethylg2dactosamine으로 ML-II와 동일한 당 특이성을 가진다 하더라도 현재까지의 연구 결과로 KML-C중 9H7-D104 반응하는 lectin 성분이 ML-II가 가지는 항원 결정기와 같거나 매우 유■사한 구조를 가진다는 것은 인정되나1侦7两) 전체 구조적으로 동일한 물질이라고는 단정할 수 없었다. 결론적으로 KML-C를 구성하는 두 lectin 성분인 KML-IIU 혹은 KML-IIL이 당 특이성 면에서는 ML-II와 동일하나 이들이 ML-II와 어느 정도의 유사성 (homology)를가지는 지에 대한 연구는 앞으로 규명해야 할 숙제라 생각 한다.
- 일반적으로 inter assay의 경우 CV 값은 10% 이내, inter assay의 경우는 15% 이내의경우는 수용할 수 있는 assay법으로 받아들여지는 바, 본 assay 결과는 실재 적용에 있어서 의 문제는 없은우수한 결과로 사료되었다. 기, 22) 겨우살이 추출물 내의 lectin 성분은 지역별, 계절별, 숙주별 차이가 있음은여러 보고에서 잘 알려진 바, 앞으로 본 assay system을 이용하여 자세한 검토를 할 예정에 있다.
- 현재까지 이러한 약재들은 다양한 추출 방법과 단일성분이 아닌 여러 복합성분을 가지는 추출물로 구성되어지기에 동일한 활성이 나타나지 않음으로 임상에서잘 받아 #여지지 않는 실정에 있다. 또한 약재의 활성성분은 물질의 채취 시기나 지역에 따른 구성물질의 차이도 보고된 바, 이러한 천연 약재를 과학적으로 인정받기 위하여는 물질의 표준화가 선행되어야 할 것이다. 물질의 표준화 차원에서 가장 높은 활성을 나타내는 지표물질의 선정과 분리 및 그의 정량법 개발은 가장 우선적으로 고려되어야 할 사항으로 사료된다.
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