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문제 정의
- 그러므로 이들의 생체 내 교란 작용의 유무를 알 수 있는 bio-marker의 개발은 시급히 이루어져야 할 것이며, 어류의 Vtg의 측정을 응용한 일련의 검출방법은 이러한 목적을 달성하기 위한 유용한 도구가 될 것이다. 따라서, 본 연구에서는 우리나라 전역에 걸쳐 1급수 우점 종으로 알려진 버들치를 사용하여 에스트로겐류 처리 시 Vtg의 발현을 조사하고, EDs의 screening을 위한 면역학적 검사법 개발의 기본 소재인 특이 단일 클론항체를 개발하고자 하였다.
- 본 연구는 2004년도 과학고 영재교육 내실화 경기도 지원사업(Estrogen류 화합물의 정량 측정법 및 Rapid kit의 개발)의 연구비 지원에 의하여 수행되었으며, 이에 대하여 감사드리는 바이다.
- 본 연구에서는 에스트로겐 유사작용을 유발시키는 EDs에 대한 대책으로, 우리나라 전역에 걸쳐 1급수 우점 종으로 알려진 버들치를 사용하여 에스트로겐 처리 시 Vtg의 발현을 조사하고, 나아가 EDs의 screening을 위한 면역학적 검사법을 위해 단일 클론항체를 개발하였다.
제안 방법
- Booster가 끝난 mouse의 spleen을 washing media에서 세척하고 mesh로 조직을 갈아 FBS를 이용한 gradient로 조직과 cell들을 분리하였다. B cell과 myeloma cell(Sp2/0)을 washing media로 각각 4회 washing하였으며, washing이 끝난 두 세포는 PEG 1500을 이용하여 5분 30초 간 세포융합을 실시하였다. 융합 후 한 번의 세척을 수행하고, 1×HAT media에 부유하였고, 96-well flat bottom plate에 200µ1씩 분주하였다.
- E2 주사한 버들치 혈청과 대조군으로서 E2 미처리 버들치 혈청이 coating된 96-well micro-plate에, 선별된 1D4, 2A4, 3D3, 3D4, 3D5 배양상층액을 반응시켜 Vtg 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 관찰하였다. 그 결과 생산된 단일 클론항체의 Vtg에 대하여 특이적으로 반응함을 알 수 있었다(Fig.
- E2 주사한 버들치의 혈청과 알 단백질을 전기영동하기 위한 SDS-PAGE를 사용하였다. Biorad(USA)의 Mini protein system을 이용하여 SDS-PAGE(7.
- E2(4µg/g body weight)를 처리하고 7일이 경과된 후, 버들치의 혈액 속에 Vtg의 생성유무를 확인하고자 혈청을 SDS-RAGE로 분리하였다. 대조군으로 E2 미처리 암컷과 미처리 수컷의 혈청을 사용하여, E2 처리 암컷과 E2 처리 수컷의 혈청을 상호 비교하였다.
- E2양에 따라서 Vtg 생성이 달라지는지 확인하기 위해서 암컷과 수컷의 혈청을 비교하였다. 혈액 시료는 버들치의 복강 내로 에스론주사액을 0.
- Vtg 생성을 유도하는 것으로 알려진 에스론주사액 (삼양약화학, 한국, Estradiol Benzoate(E2) 2mg/ml)을 버들치의 복강에 직접 주사하였다. E2는 4µg/g body weight로 버들치에 주사하였고, 일주일 후 꼬리를 잘라 채혈하였다.
- 세포융합된 세포들은 약 24시간 간격으로 10일 간 HAT media를 교환하여 주었으며, 10일 후 HT media로 바꿔주었다. colony가 형성된 well의 상등액을 희석하여 E2 주사한 버들치 혈청을 항원으로 한 1차 선별 ELISA를 수행하였다. 선별된 hybridoma cell들은 24- well plate에 옮겨져 배양하였으, 지속적인 특이항체의 분비를 ELISA로 확인한 후 양성 반응을 보이는 clone은 limit dilution하여 증식시킨 후 동결 보관하였다.
- (4µg/g body weight)를 처리하고 7일이 경과된 후, 버들치의 혈액 속에 Vtg의 생성유무를 확인하고자 혈청을 SDS-RAGE로 분리하였다. 대조군으로 E2 미처리 암컷과 미처리 수컷의 혈청을 사용하여, E2 처리 암컷과 E2 처리 수컷의 혈청을 상호 비교하였다.
- 동일 무게의 버들치에 E2(주사량 8µg/g)를 처리한 다음 E2에 의한 시간별 Vtg 생성정도를 알아보기 위해 조건 당 무작위로 2마리씩 채혈한 뒤 암·수를 구별하고 혈청을 비교하였다. 혈액은 복강주사 제 1일, 제 3일, 제 7일, 제 11일, 제 17일, 제 31일 후 채취하여 혈청을 분리하였다.
- 본 실험에서는 버들치에 E2를 처리함으로써 Vtg의 합성을 유도하였다. 또한, E2에 대한 처리량과 시간에 따른 Vtg의 발현량을 조사하였다. 면역용 항원으로 E2 처리에 의한 Vtg를 이용하여 Balb/ c mouse에 면역시켰고 spleen cell과 myelloma cell을 융합시켜 단일 클론항체를 제작하였다.
- 또한, E2에 대한 처리량과 시간에 따른 Vtg의 발현량을 조사하였다. 면역용 항원으로 E2 처리에 의한 Vtg를 이용하여 Balb/ c mouse에 면역시켰고 spleen cell과 myelloma cell을 융합시켜 단일 클론항체를 제작하였다. ELISA1를 통해 버들치 Vtg에 특이적으로 반응하는 하이브리도마를 선별하였다.
- 그러므로 수컷 혈중의 Vtg의 존재유무는 에스트로겐 유사물질에 노출되었는지를 판단하는데 있어 유용한 도구가 될 수 있다. 본 실험에서는 버들치에 E2를 처리함으로써 Vtg의 합성을 유도하였다. 또한, E2에 대한 처리량과 시간에 따른 Vtg의 발현량을 조사하였다.
- colony가 형성된 well의 상등액을 희석하여 E2 주사한 버들치 혈청을 항원으로 한 1차 선별 ELISA를 수행하였다. 선별된 hybridoma cell들은 24- well plate에 옮겨져 배양하였으, 지속적인 특이항체의 분비를 ELISA로 확인한 후 양성 반응을 보이는 clone은 limit dilution하여 증식시킨 후 동결 보관하였다.
- 세포융합된 세포들은 약 24시간 간격으로 10일 간 HAT media를 교환하여 주었으며, 10일 후 HT media로 바꿔주었다. colony가 형성된 well의 상등액을 희석하여 E2 주사한 버들치 혈청을 항원으로 한 1차 선별 ELISA를 수행하였다.
- 4월에서 6월 사이 채집한 버들치에서 알 단백질을 채취하여 Eppendorf tube로 옮겨 냉장보관 하였다. 실험 전 알을 액체질소로 급속히 냉각시킨 후 막자사발을 사용하여 균질화시킨 다음 증류수를 0.1g/ml로 첨가하여 부유시켜 원심분리(10,000×g, 5분, 4℃)하였다. 상등액을 취한 후 filteitpore size 0.
- 실험은 일반적 단일 클론항체 제작법을 따랐으며, 이를 간략히 기술하면, 생후 6-8주령의 암컷 Balb/C의 mouse에 총 6주간 immunization하였다. 주사는 2주 간격으로, 채혈은 antigen 주입 후 3-4일 후에 mouse의 꼬리에서 취하였으며, 얻은 혈청으로 antibody titer를 측정하였다.
- E2을 주사한 버들치 혈청을 전기영동하였을 경우 150kDa 부위의 band를 잘라내었으며, 알 단백질의 경우 lOOkDa 부위의 band를 잘라내어 면역에 사용하였다. 약 6주 후, antibody titer가 최고치를 나타낸 것을 확인하고, mouse의 꼬리에 3일 간의 booster 주사를 수행하였다.
- 5µg/g, 2µg/g, 5µg/g, 10µg/g 등 버들치의 body weight에 대한 농도로 주사하였으며, 일정 시간 후 꼬리를 절단하여 얻었다. 주사 시 동일 물고기로 하지 않고 조건 당 무작위로 3마리를 선택하였고, 제 9일에 꼬리에서 채혈 후 암·수 구별하여 혈청을 비교하였다. 암·수는 돌기 모양의 차이로 구분하였다.
- 실험은 일반적 단일 클론항체 제작법을 따랐으며, 이를 간략히 기술하면, 생후 6-8주령의 암컷 Balb/C의 mouse에 총 6주간 immunization하였다. 주사는 2주 간격으로, 채혈은 antigen 주입 후 3-4일 후에 mouse의 꼬리에서 취하였으며, 얻은 혈청으로 antibody titer를 측정하였다. 면역반응은 SDS-PAGE gel 상에서 원하는 band만 잘라내어 액체질소로 급속히 냉각시킨 후 막자사발로 분쇄하여 PBS에 부유하여 주사하였다.
- 양에 따라서 Vtg 생성이 달라지는지 확인하기 위해서 암컷과 수컷의 혈청을 비교하였다. 혈액 시료는 버들치의 복강 내로 에스론주사액을 0.01µg/g, 0.1µg/g, 0.5µg/g, 2µg/g, 5µg/g, 10µg/g 등 버들치의 body weight에 대한 농도로 주사하였으며, 일정 시간 후 꼬리를 절단하여 얻었다. 주사 시 동일 물고기로 하지 않고 조건 당 무작위로 3마리를 선택하였고, 제 9일에 꼬리에서 채혈 후 암·수 구별하여 혈청을 비교하였다.
- 에 의한 시간별 Vtg 생성정도를 알아보기 위해 조건 당 무작위로 2마리씩 채혈한 뒤 암·수를 구별하고 혈청을 비교하였다. 혈액은 복강주사 제 1일, 제 3일, 제 7일, 제 11일, 제 17일, 제 31일 후 채취하여 혈청을 분리하였다.
대상 데이터
- 4월에서 6월 사이 채집한 버들치에서 알 단백질을 채취하여 Eppendorf tube로 옮겨 냉장보관 하였다. 실험 전 알을 액체질소로 급속히 냉각시킨 후 막자사발을 사용하여 균질화시킨 다음 증류수를 0.
- 주사한 버들치의 혈청과 알 단백질을 전기영동하기 위한 SDS-PAGE를 사용하였다. Biorad(USA)의 Mini protein system을 이용하여 SDS-PAGE(7.5% polyacr ylamide seperating gel)를 실시히였고, stacking gel은 5%의 gel을 사용하였다.
- 면역용 항원으로 E2 처리에 의한 Vtg를 이용하여 Balb/ c mouse에 면역시켰고 spleen cell과 myelloma cell을 융합시켜 단일 클론항체를 제작하였다. ELISA1를 통해 버들치 Vtg에 특이적으로 반응하는 하이브리도마를 선별하였다. 지속적으로 항체를 분비하며 높은 역가를 띄는 5개의 하이브리도마는 Vtg에 대한 특이성을 확인하기 위해 Western blotting에 사용되었다.
- 경기도 수원시 광교산 일대에서 채집한 버들치를 사용하여 Vtg 생성을 유발하는 것으로 알려진 에스론주사액을 버들치의 복강에 주사하여 본 실험을 수행하였다.
- 그 실례로 미국 뉴욕 주-뉴저지주 항구의 토양에 잔류하고 있는 에스트로겐 유사물질을 추출하여 수컷 Fundulus heteroclitus에 직접 주사한 결과 Vtg이 생성됨을 확인하였다. 또한 산업 쓰레기와 가정 쓰레기에 의해 피해를 입고 있는 대표적 지역인 미국 Hamilton Harbour의 환경오염도 조사 시 bio-marker로서 Vtg이 사용되었다. 자연 에스트로겐과 alkylphenol 그리고 그 분해산물을 포함한 쓰레기 처리 공장 배출수가 나오는 지역인 Hamilton Harbour와 Ontario 호수의 여섯 장소에 각각 무지개 송어를 노출시킨 결과 Hamilton Harbour에 노출시킨 물고기에서 Vtg가 생성되는 것이 확인되었다.
- 본 연구에 사용한 어류는 경기도 수원시 광교산 일대 하천에서 어항(mesh 3mm×2mm)으로 채집하였으며, 경기대학교 생태학 실험실로 이동 후 순환여과식 사육수조(40×20×25cm)에서 양어용 배합사료를 먹이로 하여 사육하였다. 실험어는 최소 일주일 이상 실험실 조건(실내온도 2FC, 수온 23P)에서 적응 시킨 후 Vtg 생성 유도에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 어류는 경기도 수원시 광교산 일대 하천에서 어항(mesh 3mm×2mm)으로 채집하였으며, 경기대학교 생태학 실험실로 이동 후 순환여과식 사육수조(40×20×25cm)에서 양어용 배합사료를 먹이로 하여 사육하였다. 실험어는 최소 일주일 이상 실험실 조건(실내온도 2FC, 수온 23P)에서 적응 시킨 후 Vtg 생성 유도에 사용하였다.
이론/모형
- ELISA1를 통해 버들치 Vtg에 특이적으로 반응하는 하이브리도마를 선별하였다. 지속적으로 항체를 분비하며 높은 역가를 띄는 5개의 하이브리도마는 Vtg에 대한 특이성을 확인하기 위해 Western blotting에 사용되었다. 본 연구를 통해 개발된 항체는 버들치 Vtg에 대하여 특이적으로 반응함으로써, 수중 환경의 호르몬유사작용 물질의 존재를 판별하기 위한 생물지표로서의 Vtg를 검출하는 데 있어 유용한 도구가 될 것으로 사료된다.
성능/효과
- E2 농도가 Vtg의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 버들치의 body weight당 0.01-10µg/g으로 E2을 주사한 결과, E2의 양을 증가시킬수록 Vtg의 생성량도 증가추세를 나타냄을 확인하였다. 기존의 연구에서도 대부분의 어류에서 E2 처리 농도에 따라 Vtg 생성량이 증가함을 보여주었다.
- E2 미처리 수컷과 E2 처리 수컷의 혈청을 SDS-PAGE로 분석한 결과 E2 처리한 버들치 혈청에서만 150kDa의 진한 밴드를 확인할 수 있었다(Fig. 3a). 이 밴드가 Vtg인지 확인하기 위해서 산란기의 암컷 혈청과 비교하였을 때, 같은 위치에서 밴드가 확인되었고 E2 미처리 암컷에서는 이 밴드가 나타나지 않았다(Fig.
- E2 처리 농도가 Vtg 생성량에 미치는 영향을 알아보기 위해 버들치에 E2를 0.01µg/g, 0.1µg/g, 0.5µg/g, 2µg/g, 5µg/g, 10µg/g 등 버들치의 body weight에 대한 농도로 각각 복강주사한 결과, E2양을 증가시킬수록 Vtg의 생성량도 증가추세를 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 4a, 4b).
- 기존의 연구에서도 대부분의 어류에서 E2 처리 농도에 따라 Vtg 생성량이 증가함을 보여주었다. E2 처리량과 Vtg 생성량의 상관관계를 보았을 때, E2 농도별로 발생되는 Vtg 양은 어류의 종류에 따라 다르겠지만 버들치에서도 E2 처리량이 증가할수록 Vtg양도 증가되는 동일한 결과를 보인다는 것을 확인할 수 있었다.
- Vtg는 암컷 특유의 단백질이지만 E2에 노출되었을 때에는 성에 관계없이 생성되어지며, E2 노출량에 영향 받는다는 것을 확인하였다. 이를 토대로 본 실험을 통해 개발된 항체는 에스트로겐류 물질에 노출된 유무를 판별하는데 이용되어 질 수 있으며, 최근 환경에 존재하는 호르몬 유사작용 화학물질을 대상으로 평가하는데 있어 면역 학적 방법을 사용하여 Vtg 측정법을 개발하는데 유용한 도구가 될 것이라 사료된다.
- 결과로, E2를 4µg/g body weight을 처리하고 7일이 경과된 버들치의 암, 수컷 모두에서 미처리 대조군에서 나타나지 않은 150kDa 부근의 band를 확인할 수 있었다. 이 새로운 band는 E2의 처리로 인해 생성된 Vtg이라 추정되며, 이는 무지개 송어(Onchorynchus mykiss), 넙치(Pandichthy olivaceus), 조피볼락(Slaves schlegeli) 등 일반적으로 Vtg 생성이 관찰되는 어류 이외에 국내 하천에 널리 분포하는 버들치에서도 R이 Vtg 생성을 유도함을 확인할 수 있는 결과이다.
- 미처리 버들치 혈청이 coating된 96-well micro-plate에, 선별된 1D4, 2A4, 3D3, 3D4, 3D5 배양상층액을 반응시켜 Vtg 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 관찰하였다. 그 결과 생산된 단일 클론항체의 Vtg에 대하여 특이적으로 반응함을 알 수 있었다(Fig. 2). ELISA의 반응 결과는 E2 투여된 버들치 혈청과의 반응만을 보여주었다.
- Vtg이 난황 단백질로서 정상적인 수컷에서는 만들어지지 않는 특성을 이용하여 EDs의 에스트로겐 성 효과를 평가하는데 매우 유용한 생물지표로 이용될 수 있으며, 관련된 연구가 다수 보고되었다. 그 실례로 미국 뉴욕 주-뉴저지주 항구의 토양에 잔류하고 있는 에스트로겐 유사물질을 추출하여 수컷 Fundulus heteroclitus에 직접 주사한 결과 Vtg이 생성됨을 확인하였다. 또한 산업 쓰레기와 가정 쓰레기에 의해 피해를 입고 있는 대표적 지역인 미국 Hamilton Harbour의 환경오염도 조사 시 bio-marker로서 Vtg이 사용되었다.
- 3b). 따라서, 산란기의 암컷과 E2에 노출된 물고기의 혈청에 나타나는 단백질이 Vtg 임을 확인할 수 있었다.westem blot을 수행한 결과 E2 미처리 암수 혈청에는 어떤 반응도 나타내지 않았으나, 산란기 암컷과 E2 처리한 암수 모두 150kDa 부근의 밴드에서 반응을 나타내었다.
- 이 새로운 band는 E2의 처리로 인해 생성된 Vtg이라 추정되며, 이는 무지개 송어(Onchorynchus mykiss), 넙치(Pandichthy olivaceus), 조피볼락(Slaves schlegeli) 등 일반적으로 Vtg 생성이 관찰되는 어류 이외에 국내 하천에 널리 분포하는 버들치에서도 R이 Vtg 생성을 유도함을 확인할 수 있는 결과이다. 또한, E2을 6주간 투여한 Balb/C mouse의 B cell과 myelloma cell (Sp2/0)을 융합시켜 제작된 단일 클론항체 1D4, 2A4, 3D3, 3D4, 3D5는 위의 E2 투여된 버들치 혈청과의 ELISA 결과 특이적으로 반응함을 보여주었다. 이 단일클론항체는 E2 투여된 버들치 혈청과의 Western detection에서도 그 특이성이 대조군과 비교하여 뚜렷하게 확인됨을 보여주었다.
- 가 Vtg 생성에 관여하나, estrogen receptor의 생성도 동시에 유도하기 때문이라 사료된다. 본 실험에서는 E2를 복강주사하고 제 1일, 제3일, 제 7일, 제11일, 제 17일, 제 31일 후의 혈청을 비교하여 버들치에서는 제 7일째 발현량이 최고임을 알 수 있었다.
- ELISA의 반응 결과는 E2 투여된 버들치 혈청과의 반응만을 보여주었다. 이 결과로 Vtg 검출을 수행할 수 있는 hybridoma cell 5개를 선별할 수 있었다.
- 또한 산업 쓰레기와 가정 쓰레기에 의해 피해를 입고 있는 대표적 지역인 미국 Hamilton Harbour의 환경오염도 조사 시 bio-marker로서 Vtg이 사용되었다. 자연 에스트로겐과 alkylphenol 그리고 그 분해산물을 포함한 쓰레기 처리 공장 배출수가 나오는 지역인 Hamilton Harbour와 Ontario 호수의 여섯 장소에 각각 무지개 송어를 노출시킨 결과 Hamilton Harbour에 노출시킨 물고기에서 Vtg가 생성되는 것이 확인되었다. 이러한 이유로 난생 동물의 수컷에서 유도되는 Vtg는 외인성 에스트로겐 물질에 노출되었음을 암시하는 중요한 지표로 인정되고 있다.
후속연구
- 지속적으로 항체를 분비하며 높은 역가를 띄는 5개의 하이브리도마는 Vtg에 대한 특이성을 확인하기 위해 Western blotting에 사용되었다. 본 연구를 통해 개발된 항체는 버들치 Vtg에 대하여 특이적으로 반응함으로써, 수중 환경의 호르몬유사작용 물질의 존재를 판별하기 위한 생물지표로서의 Vtg를 검출하는 데 있어 유용한 도구가 될 것으로 사료된다.
- 에스트로겐 유사작용을 유발시키는 EDs에 대한 대책으로서, 물질의 규정과 선별된 시험방법을 개발하고 그것을 적용하는 것이 현 시점에서 가장 필요한 연구일 것이다. 그러므로 이들의 생체 내 교란 작용의 유무를 알 수 있는 bio-marker의 개발은 시급히 이루어져야 할 것이며, 어류의 Vtg의 측정을 응용한 일련의 검출방법은 이러한 목적을 달성하기 위한 유용한 도구가 될 것이다.
- 노출량에 영향 받는다는 것을 확인하였다. 이를 토대로 본 실험을 통해 개발된 항체는 에스트로겐류 물질에 노출된 유무를 판별하는데 이용되어 질 수 있으며, 최근 환경에 존재하는 호르몬 유사작용 화학물질을 대상으로 평가하는데 있어 면역 학적 방법을 사용하여 Vtg 측정법을 개발하는데 유용한 도구가 될 것이라 사료된다.
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