4-tert-octylphenol (OP) is a surfactant additive widely used in the manufacture of a variety of detergents and plastic products. Also, OP is known to have estrogenic activity by interacting with development and functions of endocrine system. This study was carried out to obtain toxicokinetic paramet...
4-tert-octylphenol (OP) is a surfactant additive widely used in the manufacture of a variety of detergents and plastic products. Also, OP is known to have estrogenic activity by interacting with development and functions of endocrine system. This study was carried out to obtain toxicokinetic parameters of OP in male Sprague-Dawley rats. Male rats were administered OP, by either single oral (gavage) applications of 50, 100 or 200 mg/kg body weight. or a single intravenous injections of 1, 5 or 10 mg/kg body weight. Blood samples taken at several time intervals after administration were obtained from the femoral artery. Analysis of blood samples for OP was performed by gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). The detection limit of OP was 1.9 ng/$m\ell$ at SIM (selected ion monitoring) mode of GC/MS. Calibration curve for analysis of the concentrations of OP in plasma was (OP/butylphenol peak area ratio) = 0.0294 $\times$ (plasma cone.) + 0.028 ($r^2$= 0.9991). The OP plasma concentration was 3921 ng/$m\ell$ immediately after single intravenous application, decreased rapidly within 45 min, and was detectable at low concentration up to 6 hr after application. When administered orally in rats (50, 100 and 200 mg/kg), OP was detected in the blood early after gavage administration, indicating the rapid initial uptake from gastrointestinal tract, with Tmax obtained from 0.67~0.83 hr. Using the AUC (area under the curve) of plasma concentration vs. time, low oral bioavailabilities of 1.2, 5.0 and 5.3% were calculated for the 50, 100 and 200 mg/kg groups, respectively.
4-tert-octylphenol (OP) is a surfactant additive widely used in the manufacture of a variety of detergents and plastic products. Also, OP is known to have estrogenic activity by interacting with development and functions of endocrine system. This study was carried out to obtain toxicokinetic parameters of OP in male Sprague-Dawley rats. Male rats were administered OP, by either single oral (gavage) applications of 50, 100 or 200 mg/kg body weight. or a single intravenous injections of 1, 5 or 10 mg/kg body weight. Blood samples taken at several time intervals after administration were obtained from the femoral artery. Analysis of blood samples for OP was performed by gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). The detection limit of OP was 1.9 ng/$m\ell$ at SIM (selected ion monitoring) mode of GC/MS. Calibration curve for analysis of the concentrations of OP in plasma was (OP/butylphenol peak area ratio) = 0.0294 $\times$ (plasma cone.) + 0.028 ($r^2$= 0.9991). The OP plasma concentration was 3921 ng/$m\ell$ immediately after single intravenous application, decreased rapidly within 45 min, and was detectable at low concentration up to 6 hr after application. When administered orally in rats (50, 100 and 200 mg/kg), OP was detected in the blood early after gavage administration, indicating the rapid initial uptake from gastrointestinal tract, with Tmax obtained from 0.67~0.83 hr. Using the AUC (area under the curve) of plasma concentration vs. time, low oral bioavailabilities of 1.2, 5.0 and 5.3% were calculated for the 50, 100 and 200 mg/kg groups, respectively.
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문제 정의
본 연구는 SD 랫드에 OP를 경구 및 정맥 내 투여한 후 혈액을 채취하여 체내 동태를 연구함으로써 생체시료 전처리 방법 및 gas chromatography/mass spectrometry(GCZMS)를 이용한 생체시료의 미량분석 방법을 확립하고 생체이용율(bioavailability) 등 체내동태 파라미터를 평가하여 내분비계 장애물질들의 독성 발현기전을 예측할 수 있는 기본 자료로 활용하고자 실시하였다.
제안 방법
정량분석된 자료들은 WinNonHn program을 이용하여 혈중농도 곡선하면 적 (AUC), 분포용적(Vs), 클리어런스(C1) 및 최고 혈중농도 (Cm。, 최고 혈중농도 도달시간(Tmax) 등의 체내동태 파라미터들을 구하였다.
MS의 분석조건은 ionization 온도가 230℃, EM 볼트는 1600V, electron impact ionization mode이었으며, GC의 분석 조건은 주입부의 온도 250℃, 유속은 분당 L7ml, oven 온도는 초기 온도 100℃ (1분), 14UC까지 분당 15℃로 상승시킨 다음 190℃까지 10℃로 상승시켰다. OP와 내부 표준물질인 BP는 GC/MS의 Scan mode를 이용하여 정성분석을 실시하였으며 Scan mode에서 얻은 OP와 BP의 spectrum을 확인한 다음, 정량 분석은 SIM mode를 이용하였다. OP와 BP의 정량 분석에 사용된 선택이온은 각각 m/z 135와 150이었다.
OP의 체내동태 파라메타를 얻기 위하여 랫드의 대퇴동맥과 정맥에 카테터(Polyethylene tube 50, Becton Dickinson, USA)를 삽입하고 OP를 정맥 내(1, 5, 10㎎/㎏) 및 경구(50, 100, 200㎎/㎏, gavage)로 투여하였다. 정맥 및 경구투여를 위한 OP는 OP의 각 농도를 계량한 다음 propylene glycol을 이용하여 용해시켰다.
정맥 및 경구투여를 위한 OP는 OP의 각 농도를 계량한 다음 propylene glycol을 이용하여 용해시켰다. 경구투여의 경우 0, 0.17, 0.33, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 6 및 24시간에 EDTA가 처리된 시험관(Microtainer tube, Becton Dickinson, USA)에 0.5 mN를 채혈하였고, 채혈 후 정맥에 삽입해 놓은 카테터를 이용하여 등장 생리식염수를 동량 주입하였다. 채혈후 동맥에 삽입해 놓은 카테터에는 혈액의 응고를 방지하기 위하여 25 IU로 희석한 헤파린액을 채워놓았다.
OP의 분석은 GC/MS의 SIM mode를 이용하였으며, 선택이온으로 내부표준물질인 BP는 m/z 135와 150, OP는m/z 135이었다. 내부 표준물질인 BP의 선택이 온 중 m/z 150이 m/z 135의 20% 이상이 될 때 정량분석을 실시하였다. Fig.
분 리된 유기층은 질소가스하(50℃ 온도 조건)에서 증발 건조 한 뒤 MTBE 1001供를 가한 후 1분간 vortex하여 잔류물을 용해시켰다. 농축된 시료는 GC/MS의 Scan 및 SIM (Single Ion Monitoring) mode를 이용하여 '분석하였다. 단 내부 표준물질의 표준용액은 5000ng/ml로 고정하여 사용하였다.
국립독성 연구소 실험동물자원실의 청정 동물실에서 사육된 220~290g의 웅성 Sprague-Dawlay 랫드를 사용하였다. 순화기간동안 폴리카보네이트 케이지에 각각 5마리씩 수용하였으며, 실험동물용 고형사료(퓨리나코리아 방사선 처리용 실험용 쥐 사료)와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 동물사육조건은 온도 23±2。(3, 상대 습도 55±5%, 12시간 조명주기 조건을 유지하였다.
웅성 SD 랫드에 정맥으로 1, 5, 10㎎/㎏을 투여한 후 실험계획에 따라 혈액을 채취하여 혈장 OP의 농도 측정 및 체내 동태학적 파라미터를 검토하였다. OP를 정맥 내 투여한 후 얻어진 혈장농도.
혈중에 미량으로 존재하는 OP의 농도는 Hewlett Packard 의 GC/MS를 이용하여 측정하였다. Columne HP-5MS capillary column(길 이 30.
대상 데이터
GC/MS는 Hewlett Packard(USA)사의 HP5973 MSD 검출기가 부착되어 있는 HP6890 GC를 사용하였으며, 전기식 지시저울은 Sartorius analytical balance(USA), 원심분리기 는 Jouan(USA), shaker는 Yamato shaker Model SA31 (Japan)을 사용하였다.
OP와 tert butyl methylethei(MTBE 98%)는 Aldrich (USA)에서 구입하였으며, 4-tert-Butylphenol(BP)은 Supelco (USA)에서, Na2SC)4와 propylene glycole Wako(Japan), heparin sodiume 녹십자(Korea)에서 구입하여 사용흐]였으며, 그 외의 시약은 특급 이상의 것을 사용하였다.
국립독성 연구소 실험동물자원실의 청정 동물실에서 사육된 220~290g의 웅성 Sprague-Dawlay 랫드를 사용하였다. 순화기간동안 폴리카보네이트 케이지에 각각 5마리씩 수용하였으며, 실험동물용 고형사료(퓨리나코리아 방사선 처리용 실험용 쥐 사료)와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.
동물사육조건은 온도 23±2。(3, 상대 습도 55±5%, 12시간 조명주기 조건을 유지하였다. 실험동물은 검체 투여 전 약 12~16시간동안 절식시킨 후 실험에 사용하였다.
성능/효과
순화기간동안 폴리카보네이트 케이지에 각각 5마리씩 수용하였으며, 실험동물용 고형사료(퓨리나코리아 방사선 처리용 실험용 쥐 사료)와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 동물사육조건은 온도 23±2。(3, 상대 습도 55±5%, 12시간 조명주기 조건을 유지하였다. 실험동물은 검체 투여 전 약 12~16시간동안 절식시킨 후 실험에 사용하였다.
100 ㎎/㎏을 경구로 투여한 후 혈장 OP 농도를 측정한 결과 1시간 이내에 평균 최고혈중 농도 (CmaQ는 134.7±24.9 ng/ml이었고 2시간 때까지 약 100 ng/ml이 검출되었으며 24시간째에는 약 10 ng/ml로 검출되었다(Fig. 5, Table 2). 체내 동태학적 파라미터인 AUC는 1036.
200 ㎎/㎏을 경구로 투여한 후 혈장 OP 농도를 측정한 결과 1시간 이내에 평균최고혈중 농도 ((爲标)는 307.4±24.6 ng/ml이었고 3시간째까지 약 100 ng/ml로 검출되었으며 24시간까지 약 40 ng/ml로 검출되었다(Fig. 5, Table 2). 또한 경구 투여군에서 혈장 OP 농도는 시간대별로 개체에 따라 큰 차이를 나타내었다.
50, 100 및 200 ㎎/㎏의 경구투여 군과 5 ㎎/㎏을 정맥투여한 군의 AUC 비율에 근거하여 절대생체 이용률을 산출한 결과 각각 L2, 5.0, 5.3%로 비교적 낮은 생체이용율 나타내었다. 이는 Certa et al.
50㎎/㎏을 경구로 투여한 후 혈장 OP 농도를 측정한 결과 1시간 이내에 평균최고혈중 농도 ((*蜘)는 42.3+8.8 ng/ml이었고 4~6시간 이내에 약 5~7ng/ml로 감소되었으며 24시간째에는 약 1 ng/ml이 검출되었다(Fig. 5, Table 2). 체내 동태학적 파라미터인 AUC는 119.
OP의 정맥투여 후 혈액을 채취하여 OP 농도를 분석한 결과 1, 5, 10 ㎎/㎏ 투여군에서 AUC는 382.8-2129.1 ng·hr/ml로 농도가 증가할수록 AUC도 비례하여 증가하는 경향을 나타내었으며(Fig. 4), 전신 클리어런스는 2.6~5.2L/ hr, 체내 반감기는 0.9-1.2 hr이었다. 이는 OP의 체내동태가 용량비의존성 또는 선형 속도론을 나타내는 것으로 사료된다.
3과 같다. OP의 투여 직후 최고혈중 농도를 나타낸 이후 45분 이내에 급격히 감소하여 6시간 때에는 약 23i也ml로 검출되었다. 체내 동 태학적 파라미터인 AUC는 1041.
IB는 경구로 OP를 투여한 다음 채취한 혈액분석 결과이다. 본 실험의 실험조건에 따라 혈장을 GC/MS로 분석한 결과 머무름 시간 (Retention time)은 내부 표준물질인 BP이 4.75분이었고 OP 은 8.40분이었다.
' 3과 같다. 투여 직후 혈중 OP의 농도는 451.2+22.7 ng/ml이었고, 투여 후 1시간까지 농도가 낮아졌으며 OP 농도는 급격히 감소하여 6시간째까지 검출되었다. 또한 AUC는382.
후속연구
OP가 estrogen 수용체와의 결합능은 estrogen이나 bisphenol A보다는 낮지만 (Nagel, 1997; 1999; Lutz & Kloas, 1999) estrogen 수용체와 결합하여 estrogen 양작 용을 나타낸다고 하였다. 따라서 estrogen 양작용을 검토하기 위해서는 0P가 estrogen 수용체와 결합능에 대한 것과 0P는 내분비 장애물질로 구분되어 있어 미량으로도 내분비계에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 생체의 각 장기나 조직으로의 이행에 대한 연구가 더욱 필요하다고 사료된다.
1시간의 혈중농도 반감기를 나타내었다. 본 연구 결과와 비교시 혈중 농도 반감기가 이들보다 빠르게 나타낸 것은 사용한 동물의 개체차 및 종별 차이가 한 원인이 될 수 있으리라 사료된다.
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