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문제 정의
- 본 연구는 동물세포에 대해 이러한 여러 기능을 갖는 Barodon-FX®을 생쥐와 소의 초기배 체외배양시 첨가될 때 세포증식과 배반포 발달율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
-
4. 소 체외수정란의 체외배양
체외수정란을 얻기 위하여 먼저 도살우의 난소로부터 채란된 미성숙 난포란을 체외성숙배양액 (TCM199에 10% FCS, 1 "l/ml FSH, 1 “1/ml hCG, 1 ^1/ml estradiol-17/9, 항생제 첨가)에서 과립막세포(1.0xl06/mI)와 공배양하면서 22-24시간 체외성숙 시켰다.
- 실시하였다. 1CR계 성숙 생쥐의 과배란 유도를 위하여 5-10IU PMSG를 복강내 주사 후 48 시간 뒤에 5~ 10IU hCG 주사와 동시에 수컷과 합사하였고 hCG 주사 후 27~28시간에 수정란을 난관으로부터 채란하였다.
- 5, 1, 2%)이 첨가된 TCM199+ 10%FCS의 소적내에서 소 난관상피세포(BOEC) 또는 과립막세포(GC)와 공동배양하였으며 배양액은 48시간마다 신선한 배양액으로 교환하였다. 5% CO2, 95% 공기, 39℃에서 9일간 배양 후 배반포기까지의 배 발달율을 조사하였다.
- Barodon 첨가농도의 유해 여부와 최적 첨가 수준을 결정하기 위하여 생쥐 수정란으로 먼저 배양실험을 실시하였다. 1CR계 성숙 생쥐의 과배란 유도를 위하여 5-10IU PMSG를 복강내 주사 후 48 시간 뒤에 5~ 10IU hCG 주사와 동시에 수컷과 합사하였고 hCG 주사 후 27~28시간에 수정란을 난관으로부터 채란하였다.
- Barodon가 체세포에 미치는 영향을 먼저 알기위하여 이들 세 종류의 체세포를 TCM199에 넣고원심분리(l, 500rpm, 5분)로 2회 세척한 다음 각 수준의 BarodonO] 첨가된 기본배양액으로 각각 1회추가 원심분리 후 일정한 체세포농도(6~8X10, /ml)로 5ml씩 재부유하였다. 체세포부유액(5ml)은 50ml, 25cm2 배양 flask에서 5% CO2, 95% 공기, 39℃ 조건의 배양기에서 연속 3세대 계대배양한다음 8일간 추가 배양하면서 Barodon의 첨가수준별 체세포 증식효과를 비교하였다.
- 약 20시간의 체외수정 후 난자 주위의 난구세포를 제거한 다음 2~4세포기 수정란을 5개 수준의 Barodon(0, 0.25, 0.5, 1, 2%)이 첨가된 TCM199+ 10%FCS의 소적내에서 소 난관상피세포(BOEC) 또는 과립막세포(GC)와 공동배양하였으며 배양액은 48시간마다 신선한 배양액으로 교환하였다. 5% CO2, 95% 공기, 39℃에서 9일간 배양 후 배반포기까지의 배 발달율을 조사하였다.
- 체 외배 양은 0.4% BSA 또는 0.4% PVP(polyvinyl- prrolidone)가 함유된 기본 M16 배양액에 각각 5개 수준(0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0%)의 Barodon를 첨가한 체외배양액에서 6일간 배양하였다.
- 체세포부유액(5ml)은 50ml, 25cm2 배양 flask에서 5% CO2, 95% 공기, 39℃ 조건의 배양기에서 연속 3세대 계대배양한다음 8일간 추가 배양하면서 Barodon의 첨가수준별 체세포 증식효과를 비교하였다.
- 체외수정은 동결 융해한 소정액을 ImM caffeine이 함유된 BO액으로 원심 분리하여 2회 세척한 다음 5mM caffeine과 5% heparin 함유 BO 액으로 재차 원심분리 후 체외수정 배양액 내에 정자 농도 2.5xl06/ml의 정자부유액을 만들고 체외성숙 난자 10~15개가 들어있는 50μ1 소적 내에 넣어서 체외수정시켰다.
대상 데이터
- 체외수정란의 공동배양을 위한 소의 난관상피세포(bovine oviduct epithelial cells, BOEC)는 도축된 소의 난관으로부터 채취하였으며, 과립막세포 (granulosa cells, GC)와 난구세포(cumulus cells, CC)는 도살된 소 난소의 난포(직경 2~6mm)로부터 채취하였다.
성능/효과
- 0.5% Barodon 첨가시 상실배+배반포 발달율이 BOEC(50.0%)와 GC(63.6%)에서 모두 대조구(31.6 %와 27.4%)보다 월등히 높았다(Table 5). 그러나배반포 발달율은 BOEC에서는 0.
- Barodon 첨가가 공배양 세포증식에 미치는 영향을 조사한 실험에서 난관상피세포(BOEC)와 과립 막 세포(GC)의 경우 0.25-0.5% Barodon 첨가에서 세포증식이 무첨가보다 각각 24~41%와 17~ 22% 더 크게 향상되었다. 그러나 난구 세포(CC)에서는 증식효과가 없었다.
- Barodon 첨가가 초기배에 미치는 유해 여부를조사한 실험에서 BSA 함유 배양액에서는 0.25% 와 0.5% Barodon첨가에서 모두 배반포 발달율은대조구와 차이가 없었다. 그러나 1.
- Barodon 첨가에 따른 체세포 증식율이 BOEC에서 현저히 높았으나 GC와 CC에서는 1% 이상 첨가 시 증식율이 크게 저하되었던 결과에서 Barodon 효과가 세포에 따라 다른 것으로 사료되었다. 난소 세포에서 1~2% 첨가시 세포증식이 억제된 결과는 배양액의 pH, 삼투압 및 이온변화 증가에 기인된 세포증식의 억제가 상피세포보다 훨씬 컸던 것으로 사료되었다.
- 결론적으로 Barodon의 세포증식효과는 세포종류에 따라 차이가 많았으며 0.5% 수준의 첨가는 소 초기배의 배반포발달율을 향상시킬 수 있었다.
- BSA대신 PVP 첨가 배양액에서는 전체 배반포발달율이 BSA 첨가 배양액과 동일한 경향을 나타냈다. 그러나 0.5% 첨가시 부화과정 이후의 배반포가 대조구의 32.5%보다 훨씬 높은 54.7%를 보였으며, 1.0% 이상 첨가에서는 현저히 감소하였다 (Table 3).
- 5% Barodon첨가에서 모두 배반포 발달율은대조구와 차이가 없었다. 그러나 1.0~2.0% 첨가에서 현저히 감소하였으며 부화과정 이후의 배반포율은 0.5%에서도 현저히 감소하였다(Table 2). BSA대신 PVP 첨가 배양액에서는 전체 배반포발달율이 BSA 첨가 배양액과 동일한 경향을 나타냈다.
- 그러나 BSA와 PVP에서 모두 1-2% Barodone유해한 수준이었고 배반포 발달이 크게 억제 또는 증지되었는데 그 원인은 본 연구에서 확인할 수는 없었다. 일반적으로 생쥐 초기배는 pH와 삼투압에 대한 적응범위(6.
- 난소 세포에서 1~2% 첨가시 세포증식이 억제된 결과는 배양액의 pH, 삼투압 및 이온변화 증가에 기인된 세포증식의 억제가 상피세포보다 훨씬 컸던 것으로 사료되었다. Harwell과 Getteridge(1999)도 세포내 이온균형에 대한 세포기능의 변화가 세포 간에 차이가 크며 세포의 항산화 방어기능에도 조직과 세포간에 차이가 매우 큼을 지적한 바 있다.
- 한편 Chu- batsu와 Meneghini(1993)는 햄스터 난소세포에는 Ag+ 등 중금속이온을 가지며 -SH group이 높고 항산화제 성질을 가진 metallothionin 단백질이 많기 때문에 H2O2 손상에 대한 저항성이 높다고 하였다. 난소세포에서의 이러한 결과로 볼 때 본 연구의 GC와 CC에서 세포증식이 억제되었던 것은 Barodon 첨가농도와 밀접한 관계가 있었던 것으로 사료되었다.
- 5% Barodon이 초기배 체외배양에서 초기배의 발달중지현상을 극복하는데 다소 유리하게 작용한 것으로 사료되었다. 또한 1~2% Baro- don의 조건에서 생쥐의 배반포 발달율이 크게 저하되었으며(Table 3과 4) BOEC의 세포증식율이 크게 증가되었던 것(Table 5)으로 보아 Barodon의 영향이 공동배양세포인 체세포에서 더 유리하게 작용하며 그 결과 높은 농도에 대한 불리한 조건이 이들 공동세포에 의해 다소 완화되었던 것으로 사료되었다.
- 25% Barodon에서 크게 부화 배 반포 발달율이 향상되었다. 또한 BSA와 PVP 첨가에서 모두 2% Barodon 첨가에서 부화 배반포 발달율 크게 저하되었다.
- 그러나 난구 세포(CC)에서는 증식효과가 없었다. 또한 GC와 CC에서는 1%이상 첨가시 세포증식이 크게 억제되었다(Table 4).
- 생쥐 초기배 배양에서 BSA첨가시 0.25% Baro- don의 효과가 없었으나 BAS대신 PVP 첨가에서는 0.25% Barodon에서 크게 부화 배 반포 발달율이 향상되었다. 또한 BSA와 PVP 첨가에서 모두 2% Barodon 첨가에서 부화 배반포 발달율 크게 저하되었다.
- 생쥐 초기배의 배반포 발달율이 BSA첨가 배양액에 Barodon-FX® 첨가로 증가되지 않았으나 PVP 첨가 배양액에 0.25% 첨가에서는 부화배반포발달율이 54.7%로 대조구(32.5%)보다 크게 향상되었다(P< 0.05). 1-2% Barodon 첨가는 배발달을 월등히 저하시켰다.
- 소 초기배에서 상실배 이후로의 배발달율이 BOEC와 GC 체세포 공동배양조건에서 0.5% Barodon 첨가시 크게 향상되었고 한편 배반포 발달율에서는 모든 첨가 수준에서 대조구와 차이가 없는데 이는 0.5% Barodon이 초기배 체외배양에서 초기배의 발달중지현상을 극복하는데 다소 유리하게 작용한 것으로 사료되었다. 또한 1~2% Baro- don의 조건에서 생쥐의 배반포 발달율이 크게 저하되었으며(Table 3과 4) BOEC의 세포증식율이 크게 증가되었던 것(Table 5)으로 보아 Barodon의 영향이 공동배양세포인 체세포에서 더 유리하게 작용하며 그 결과 높은 농도에 대한 불리한 조건이 이들 공동세포에 의해 다소 완화되었던 것으로 사료되었다.
- 소 초기배에서 상실배이상의 배발달율은 BOEC 와 GC 공배 양조건에서 Barodon 0.5% 첨가에서 대조구보다 크게 향상되 었다(P< 0.05). 그러나 다른처리수준에서는 배발달율이 대조구와 차이가 없었다.
- 한편 Barodon의 효과가 세포간에 차이를 나타낸 결과는 동물 초기배의 체외 배발달율을 높이기 위하여 이용되고 있는 공동배양 체세포의 기능촉진을 위해서 Barodon 첨가시 체세포의 선택도 주요 고려사항이 됨을 보여주었다. 또한 BOEC에서 더 좋았던 결과가 세포 자체의 항산화 기능과 Baro- don간에 어떤 관계가 있는지에 대해서는 앞으로 더 연구가 이뤄져야 할 것이다.
후속연구
- 고려사항이 됨을 보여주었다. 또한 BOEC에서 더 좋았던 결과가 세포 자체의 항산화 기능과 Baro- don간에 어떤 관계가 있는지에 대해서는 앞으로 더 연구가 이뤄져야 할 것이다.
- 일반적으로 생쥐 초기배는 pH와 삼투압에 대한 적응범위(6.0~7.8과 200~354mOsm)가 상당히 높은데(Brinster, 1965) 본 배양액도 이 범위에 속했기 때문에 pH와 삼투압 이외의 다른 요인과 관련이 있을 것으로 생각되며 더욱 연구되어야 할 부분이다.
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