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문제 정의
- 한편, Yang 등16)의 연구결과에서는 적변삼의 표피조직에서 철이온의 함량이 건전삼의표피에 비해 2~3배 높게 확인되었다. 따라서 적변삼 포장으로부터 분리된 미생물16)의 철이온 대사와 관련된 생리적특성을 조사하여 철이온 대사와 미생물과의 관계 그리고 적변현상 유발과정에서 근권 미생물의 역할을 구명하고자 하였다.
제안 방법
- 1%(w/v) carboxymethylcellu- lose(CMC)가 포함된 2%(w/v) agarose plate를 만든 다음, 3 μL의 효소액을 떨어뜨렸다. Plate를 37℃에서 30 분간 반응시킨 다음 0.1%(w/v) Congo red로 염색하여 CMC 분해 정도를 관찰하였다. 또한 정량분석은 Beguin19)의 방법을 다소 수정하여 수행하였다.
- 건전삼과 적변삼 그리고 근권토양에서 분리된 토양세균의 초미세구조는 주사전자현미경 (Scaning Electron Microscope; SEM)을 이용하여 관찰하였다. 분리된 미생물을 523 고체 배지에 점적한 다음 28℃에서 배양하여 colony가 형성되면 배지와 함께 절편으로 만들어 2.
- 건전삼과 적변삼의 근권토양과 적변삼으로부터 분리한 토양세균의 cellulase 활성은 Garhardt 등18)의 방법을 다소 변형하여 수행하였다. 철이온과 pH가 다르게 조절된 배지에서배양한 토양세균을 동일한 밀도로 조절하여 3000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다.
- 5%(v/v) glutaraldehyde로 전고 정한 다음 l%(v/v) osmium tetraoxide(OsO4)로 후 고정을 하였다. 고정이 끝난 시료는 alcohol series와 isoamylac- etate로 탈수한 후 gold coating하여 SEM(Hitachi SENS- 570, Japan)으로 관찰16,17)하였다.
- 1%(w/v) Congo red로 염색하여 CMC 분해 정도를 관찰하였다. 또한 정량분석은 Beguin19)의 방법을 다소 수정하여 수행하였다. 0.
- 분리된 미생물의 iron 산화능력을 검정하기 위하여 Temple 배지20)에 접종하여 28℃에서 배양하면서 철 산화에 의한 배지의 turbidity(%)로 확인하였다.
- 철이온과 pH가 다르게 조절된 배지에서배양한 토양세균을 동일한 밀도로 조절하여 3000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상등액은 세포 외 효소액으로 하였으며, 침전물을 2 mL 0.05M Acetate buffer(pH 5.5)에 현탁하여 원심분리한 후 상등액을 세포 내 효소액으로 하여 활성을 조사하였다.
- 선별된 6종의 토양세균의 생리적 특성을 조사하여 적변현상과 토양세균 사이의 연관성을 구명하기 위해 pH 변화에대한 생장 특성을 조사하였다. 그 결과, pH 3.
- 적변삼 근권에서 분리한 미생물16)의 생리적 특성을 확인하기 위하여 YEB(beef extract 5g, peptone 5g, yeast ext ract lg, MgSO4· 7H2O 0.406g, sucrose 5g, H2O 1L)배지를 이용하여 철이온 및 pH 변화에 대한 생장 특성을 조사하였다. 철이 온(Fe3+) 은 2 mM ferric ammonium sulfate (Fe(SO4)3(NH4)2SO4· 24H2O}를 EDTA와 킬레이트 하였고 pH를 각각 5.
- 406g, sucrose 5g, H2O 1L)배지를 이용하여 철이온 및 pH 변화에 대한 생장 특성을 조사하였다. 철이 온(Fe3+) 은 2 mM ferric ammonium sulfate (Fe(SO4)3(NH4)2SO4· 24H2O}를 EDTA와 킬레이트 하였고 pH를 각각 5.0, 7.0, 9.0으로 조절한 배지에 배양하였다. 토양세균의 생장율은 접종 밀도를(λ660=0.
- 0으로 조절한 배지에 배양하였다. 토양세균의 생장율은 접종 밀도를(λ660=0.4) 일정하게 조절한 다음 28℃에서 암조건에서 진탕배양(110 rpm)하면서 4시간 간격으로 밀도를 측정하여 계산하였다.
성능/효과
- 이러한 결과는 RCS와 RCG는 철 이온의 산화 환원 능력이 활발하다는 것을 의미하는 것으로 식물체의근권에서 철이온의 이용도에 따라 토양세균의 생장과 증식이 영향을 받는다는 것이 확인되었다.21)세균의 철이온 산화 환원 능력은 세균의 종류에 따라 다르기 때문에 세균 상호 간에도 흡수에 영향을 받아 생장에 영향을 준다. 적변현상이 인삼의 표피세포에 철이온의 침적과 상호관계가 있음16)을 상기해 볼 때, 이들 토양세균의 철이온 산화환원 활성은 적 변 현상 유발과 매우 밀접한 관련이 있을 것으로 판단되며 분리된 토양세균을 주사전자현미경 (SEM)으로 관찰한 결과, RCS와 RCG는 모두 간균으로 확인되었다(Fig.
- 이러한 세포벽 분해산물과 세포가 파괴되어 유출되는 세포 내용물은 Fe2+ 이온과 5- 또는 6- membered ring을 쉽게 형성23)하여 인삼뿌리의 표피에 적변현상이 유발되는 것으로 판단된다. 결론적으로 유기물질이 풍부한 humus 토양(청초)에서 적변삼의 출현이 낮은 이유도바로 토양의 철세균과 Fe3+의 산화환원 작용에 기인되는 것으로 추론된다.
- 생장 특성을 조사하였다. 그 결과, pH 3.0 배지에서는분리된 모든 토양세균의 생장이 억제되었으며, pH 5.0에서는적변삼의 표피조직에서 분리된 세균(RCG)과 적변삼 근권토양에서 분리된 세균(RCS)의 생장이 다소 높았고, pH 7.0에서는 RCS와 적변 중기의 인삼의 근권토양에서 분리된 세균 (RCS++) 그리고 표토에서 분리된 세균(SUS)이 높은 생장을보였다(Fig. 1A). 반면에, 2mM Fe3+가 첨가된 배지의 모든 pH 조건에서 RCG는 비교적 높은 생장을 보였으나 다른 미생물의 생장은 현저히 억제되었다(Fig.
- 하는 것이다. 또한 적변삼의 근권 토양에서 분리한 토양세균의 cellulase 활성이 높은 점과 Fe3+ 첨가에 의해 활성도가 현저하게 증가되는 현상은 이들미생물과 적변현상 그리고 근권의 철이온과의 상호 작용에대한 현상임을 잘 뒷받침하고 있다.
- 1A). 반면에, 2mM Fe3+가 첨가된 배지의 모든 pH 조건에서 RCG는 비교적 높은 생장을 보였으나 다른 미생물의 생장은 현저히 억제되었다(Fig. IB). 뿐만 아니라 RCS와 RCG 토양세균은 철이온이 포함된 pH 3.
- 0에 비해 다소 낮았다. 분리된 모든토양세균의 cellulase 효소활성은 철이온이 포함된 배지에서철이온이 없는 배지보다 2배 이상 높게 나타났다. 세포 외효소 활성은 세포 내 효소 활성보다 약 10 이상 높았고, pH 5.
- 분리된 토양세 균의 세포 내(intracellular) 및 세포 외 (extracellular)의 cellulase 활성을 측정한 결과, 선별된 모든토양세균 공히 cellulose(CMC)를 분해하는 능력이 있음이 확인되었다(Fig. 3). pH 변화에 따른 세포 내 효소활성은 pH 7.
- 분리한 토양세균의 Fe2+ 산화 능력을 조사한 결과, 분리한 모든 토양세균들은 pH 5.8에서 Fe2+를 Fe3+로 산화하는 능력이 있음이 확인되었다(Table 1). 이들은 Temple 배지에 배양하였을 경우 약 2~3일이 경과하면 Fe2+를 산화시켜 배지 내에 침전물을 형성하였다.
- 분리된 모든토양세균의 cellulase 효소활성은 철이온이 포함된 배지에서철이온이 없는 배지보다 2배 이상 높게 나타났다. 세포 외효소 활성은 세포 내 효소 활성보다 약 10 이상 높았고, pH 5.0에서 RCS의 효소활성은 pH 7.0 보다 2배 이상 높았다. 특히, 2 mM Fe3+가 포함된 배지에서 RCS의 세포 내 효소활성은 철이온이 없는 배지보다 6~7 배 높았고 세포 외 효소의 경우에는 11-12 배가 증가되었다.
- 0 조건에서도 생장이 되었다. 이러한 결과는 RCS와 RCG는 철 이온의 산화 환원 능력이 활발하다는 것을 의미하는 것으로 식물체의근권에서 철이온의 이용도에 따라 토양세균의 생장과 증식이 영향을 받는다는 것이 확인되었다.21)세균의 철이온 산화 환원 능력은 세균의 종류에 따라 다르기 때문에 세균 상호 간에도 흡수에 영향을 받아 생장에 영향을 준다.
- 이상의 결과로 미루어 볼 때, 적변현상은 철 산화 및 철의존성 토양세균의 집적과 그들의 대사활성의 변화로 인해근권에 환원된 철이온의 농도가 높아지고, mobilization된 철이온은 뿌리의 iron-reductase(turbo enzyme) 활성에 의해일부가 흡수되기도 하지만 토양세균에 의해 부분적으로 분해된 인삼표피 구성성분 특히, cellulose 분해산물과 강력한 ligand를 형성하는 것으로 판단된다. 철 흡수 능력은 식물체마다 다양하며 일반적으로 ligand :Fe의 비율에 따라 영향을받게된다.
- 적변삼과 건전삼 그리고 이들의 근권토양으로부터 분리한토양세균과 적변현상과의 관계를 구명하고자 pH 변화와 철이온에 따른 토양세균의 생장 특성을 조사한 결과, 분리된 모든 토양세균은 pH 3.0에서는 생장하지 못하였다. 그러나 RCG와 RCS는 2 mM Fe3+가 포함된 배지에서는 pH 3.
- 0 사이에서는 생장에 큰 차이가 없었으나, 건전삼의 근권토양에서 분리된 토양세균(HES)은 다른 곳에서 분리된 세균에비해 생장이 낮았다. 적변삼의 근권토양에서 분리한 토양세균(RCS)과 표토에서 분리한 토양세균(SUS)의 생장은 pH 5.0에서 pH 7.0과 pH 9.0에 비해 다소 낮았다. 분리된 모든토양세균의 cellulase 효소활성은 철이온이 포함된 배지에서철이온이 없는 배지보다 2배 이상 높게 나타났다.
- 특히, RCG의 경우는 철이 포함된 배지에서는 철이 없는 배지보다 생장이 2배 정도 높았다. 적변삼의 뿌리에서 분리된 토양세균(RCG)은 pH 5.0에서 pH 9.0 사이에서는 생장에 큰 차이가 없었으나, 건전삼의 근권토양에서 분리된 토양세균(HES)은 다른 곳에서 분리된 세균에비해 생장이 낮았다. 적변삼의 근권토양에서 분리한 토양세균(RCS)과 표토에서 분리한 토양세균(SUS)의 생장은 pH 5.
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