본 연구는 random primer를 이용하여 PCR을 수행하기 위한 딸기 DNA증폭의 최적조건을 구명하여 조직배양된 딸기 배양묘와 모본과의 유전적인 동일성의 여부 및 품종을 판별할 수 있는 marker를 개발하기 위하여 수행하였다. 추출한 딸기 커(\ulcorner)잣 DNA를 proteinase-K나 RNase-H를 처리하였을때 깨끗하고 순수한 DNA band를 확인할 수 있었으며, 50ng의 template DNA, 10pmol의 primer, 37oC annealing 온도로 45 cycle로서 PCR을 행하는 것이 가장 효율적이었다. 상기 실험결과로서 PCR적정조건을 확립한 후, UBC primer를 대상으로 딸기 여봉 DNA에서 PCR를 수행하여 RAPD의 양상을 조사한 결과 총 90개의 primer 중에서 딸기 genomic DNA에서 PCR product를 형성한 것은 46개였으며, 총 형성된 band의 수는 158개로 나타났다. Band를 형성한 primer와 band를 형성하지 않은 primer간의 GC content를 비교하면 band를 형성한 primer의 경우 GC content는 평균 67.4%이었다. 그러나 band를 형성하지 못한 primer의 경우에는GC함량이 평균58%이었다.
본 연구는 random primer를 이용하여 PCR을 수행하기 위한 딸기 DNA증폭의 최적조건을 구명하여 조직배양된 딸기 배양묘와 모본과의 유전적인 동일성의 여부 및 품종을 판별할 수 있는 marker를 개발하기 위하여 수행하였다. 추출한 딸기 커(\ulcorner)잣 DNA를 proteinase-K나 RNase-H를 처리하였을때 깨끗하고 순수한 DNA band를 확인할 수 있었으며, 50ng의 template DNA, 10pmol의 primer, 37oC annealing 온도로 45 cycle로서 PCR을 행하는 것이 가장 효율적이었다. 상기 실험결과로서 PCR적정조건을 확립한 후, UBC primer를 대상으로 딸기 여봉 DNA에서 PCR를 수행하여 RAPD의 양상을 조사한 결과 총 90개의 primer 중에서 딸기 genomic DNA에서 PCR product를 형성한 것은 46개였으며, 총 형성된 band의 수는 158개로 나타났다. Band를 형성한 primer와 band를 형성하지 않은 primer간의 GC content를 비교하면 band를 형성한 primer의 경우 GC content는 평균 67.4%이었다. 그러나 band를 형성하지 못한 primer의 경우에는GC함량이 평균58%이었다.
This study was performed to select marker which can identify genetic variation between mother plant and in vitro cultured plantlets of strawberry by PCR using random primer. When 'Yeobong' DNA extracted was treated with proteinase-K and RNase-H, clear DNA bands were shown. The optimal condition for ...
This study was performed to select marker which can identify genetic variation between mother plant and in vitro cultured plantlets of strawberry by PCR using random primer. When 'Yeobong' DNA extracted was treated with proteinase-K and RNase-H, clear DNA bands were shown. The optimal condition for RAPD in strawberry was to use 50ng of template DNA, 10pmol of primer,37oC of annealing temperature, and 45 cycles of PCR. After establishing above PCR optimal condition, RAPD pattern was investigated by using UBC primers. PCR was performed, and 46 of 90 primers produced PCR product showing 158 total bands. GC content was compared between the primers forming bands and no bands. The GC content showing bands was average 67.4%, whereas primers showing no bands 58%.
This study was performed to select marker which can identify genetic variation between mother plant and in vitro cultured plantlets of strawberry by PCR using random primer. When 'Yeobong' DNA extracted was treated with proteinase-K and RNase-H, clear DNA bands were shown. The optimal condition for RAPD in strawberry was to use 50ng of template DNA, 10pmol of primer,37oC of annealing temperature, and 45 cycles of PCR. After establishing above PCR optimal condition, RAPD pattern was investigated by using UBC primers. PCR was performed, and 46 of 90 primers produced PCR product showing 158 total bands. GC content was compared between the primers forming bands and no bands. The GC content showing bands was average 67.4%, whereas primers showing no bands 58%.
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문제 정의
기내 배양에 의해서 생산된 딸기의 유묘와 모본과의 유전적인 동일성 여부를 RAPD 방법으로 확인하고자 하였다. 따라서 효율적인 RAPD를 위해 우선 포장과 기내에서 생육 중인 딸기의 엽과 뿌리 그리고 런너에서 채취한 조직으로부터 total genomic DNA를 분리하였다.
핵심이라 할 수 있다. 딸기는 순수한 DNA 추출이 다른 작물에 비하여 어려워서 PCR을 수행하는 데에 있어서 문제점이 많아서 본 실험에서는 RAPD를 위한 PCR을 수행하는 데에 있어서의 최적조건을 구명하여 RAPD 뿐만이 아니고 딸기 DNA를 재 료로 하여 PCR을 수행하는 다른 실험에서도 도움이 되고자 수행 하였다.
본 연구는 random primer를 이용하여 PCR을 수행하기 위한 딸기 DNA 증폭의 최적 조건을 구명 하여 조직 배양된 딸기 배양묘와 모본과의 유전적인 동일성의 여부 및 품종을 판별할 수 있는 marker를 개발하기 위하여 수행하였다. 추출한 딸기커(ㅊ)잣 DNA를 proteinase-K나 RNase-H를 처리하였을 때 깨끗하고 순수한 DNA band를 확인할 수 있었으며, 50ng의 template DNA, lOpmol의 primer, 37℃ annealing 온도로 45 cycle로서 PCR을 행하는 것이 가장 효율적이었다.
제안 방법
딸기의 품종인 "여봉"의 DNA 추출은 Dellaporta (1983)의 방법을 변형하여 DNA 추출을 하였다. 어린 식물체 조직의 디스크 절편직경이 0.
PCR을 위한 딸기 genomic DNA의 최적 농도 조건을 구명하기 위해 genomic DNA를 1ng, 10ng, 50ng, 100ng, 1000ng의 조건으로 PCR을 행하였으며 primer의 최적 농도를 구명하기 위해서 캐나다 콜롬비아 대학에서 제작한 UBC primer 300번대와 800번대를 각각 100개씩 선정하여 primer의 농도를 Ipmol, 1.6pmol, 5pmol, lOpmol로 하였다. PCR의 최적 Annealing 온도를 구명하기 위하여 37℃, 45℃, 55℃로 달리하여 PCR을 실시하였다.
PCR의 최적 Annealing 온도를 구명하기 위하여 37℃, 45℃, 55℃로 달리하여 PCR을 실시하였다. PCR을 행하기 위한 총량은 20㎕로 Perkin-Elmer DNA recovery(Sereal No. P 17806)를 사용하여 DNA fragment를 증폭하였다.
6pmol, 5pmol, lOpmol로 하였다. PCR의 최적 Annealing 온도를 구명하기 위하여 37℃, 45℃, 55℃로 달리하여 PCR을 실시하였다. PCR을 행하기 위한 총량은 20㎕로 Perkin-Elmer DNA recovery(Sereal No.
4. RAPD band pattern amplified from strawberry genomic DNA by using selected UBC primers(No. 30, 31, 50, 302, 308, 309, 346, 352, 358, 361, 362 and 368) and by using three different cultivars (A, Bokyo; B, Suhong; C, Yeobong). M:marker.
가장 효과적인 PCR조건을 구명하기 위해서 우선 추출한 DNA의 함량별로 PCR조건을 조사하였다. Ing의 genomic DNA를 이용하여 PCR을 행한 결과에서는 증폭된 DNA band를 볼 수가 없었으나, 10ng 이상에서부터는 DNA band를 확인할 수 있었다(Fig.
하였다. 따라서 효율적인 RAPD를 위해 우선 포장과 기내에서 생육 중인 딸기의 엽과 뿌리 그리고 런너에서 채취한 조직으로부터 total genomic DNA를 분리하였다. 분리 방법은 Dellaporta(1983) 방법을 약간 변형하여 수행하였던 바, CTAB을 사용하는 방법에 비해 매우 간편하면서도 빨리 DNA를 분리할 수 있었다(Fig.
딸기 '여봉' genomic DNA를 이용한 polymerase chain reaction(PCR)의 조건을 찾기 위해 PCR을 행하였다. PCR을 위한 딸기 genomic DNA의 최적 농도 조건을 구명하기 위해 genomic DNA를 1ng, 10ng, 50ng, 100ng, 1000ng의 조건으로 PCR을 행하였으며 primer의 최적 농도를 구명하기 위해서 캐나다 콜롬비아 대학에서 제작한 UBC primer 300번대와 800번대를 각각 100개씩 선정하여 primer의 농도를 Ipmol, 1.
딸기 genomic DNA의 증폭에 있어서 primer의 농도를 1pmol, 1.6mol, 5pmol, lOpmol로 달리하여 RAPD 양상을 조사하였다. lOpmol의 농도에서 DNA band가 선명하였고(Fig.
성능/효과
총 90 개의 primer 중에서 딸기 genomic DNA에서 PCR product를 형성한 것은 46개의 primer였으며, 총 형성된 band의 수는 158개로 나타났다(Table 1). Band를 형성한 primer와 band를 형성하지 않은 primer간의 GC content를 비교하면 band를 형성한 primer의 경우 GC content는 평균 67.4%이었다. 그러나 band를 형성하지 못한 primer의 경우에는 GC content가 평균 58%이었다.
또한 DNA의 함량이 10ng보다 많을수록 PCR product가 선명히 나타나 50ng에서는 DNA band가비교적 선명하였으나 100ng에서 가장 선명하였다. 그러나 l00ng에서는 희미한 가짜 band들이 많이 출현되어 효율적인 PCR를 위해서는 DNA의 함량을 50ng으로 하는 것이 좋은 것으로 판단되었다. 수도의 genome 분석에서 金(1997)도 micro-satellite primer를 이용하여 PCR을 행할 때 50ng 이상이면 1Kb 이하는 거의 증폭이 되지 않아 전기영동시 좋은 결과를 얻을 수가 없어서 50ng이 가장 적당하였다고 하여 본 실험의 결과와도 일치하였다.
온도가 높은 경우(55℃ 경우)에는 본 실험에서와 같이 band가 전혀 형성되지 않고 반대로 annealing 온도가 너무 낮으면 재현성이 없는 band가 많이 나오기 때문에 온도를 높이는 것이 specific한 band를 획득하는데 유리하다. 그러나 본 실험에서는 오히려 45℃보다 37℃에서 더 양호한 band가 형성되어 딸기 DNA의 경우에는 37℃가 좋은 것으로 사료되었다. 즉, template DNA의 함량이 50ng, primer 농도는 l0pmol, annealing 온도는 37 ℃, 증폭회수는 45회로 하여 PCR을 수행하였을 때 가장 양호한 결과를 나타내었다(Fig.
2- A). 또한 DNA의 함량이 10ng보다 많을수록 PCR product가 선명히 나타나 50ng에서는 DNA band가비교적 선명하였으나 100ng에서 가장 선명하였다. 그러나 l00ng에서는 희미한 가짜 band들이 많이 출현되어 효율적인 PCR를 위해서는 DNA의 함량을 50ng으로 하는 것이 좋은 것으로 판단되었다.
그 온도가 달라진다. 본 실험에서는 io mer의 RAPD primer를 사용하여 annealing 온도를 37℃, 45℃, 55℃로 달리하여 PCR을 실시하였던 바, 55℃ 이상에서는 전혀 band가 형성되지 않았으나(Fig. 3-C), 37℃와 45℃에서는 band를 확인할 수 있었다(Fig. 3- A and B).
추출한 딸기커(ㅊ)잣 DNA를 proteinase-K나 RNase-H를 처리하였을 때 깨끗하고 순수한 DNA band를 확인할 수 있었으며, 50ng의 template DNA, lOpmol의 primer, 37℃ annealing 온도로 45 cycle로서 PCR을 행하는 것이 가장 효율적이었다. 상기 실험 결과로서 PCR 적정 조건을 확립 한 후, UBC primer를 대상으로 딸기 여봉 DNA에서 PCR를 수행하여 RAPD의 양상을 조사한 결과 총 90개의 primer 중에서 딸기 genomic DNA에서 PCR product를 형성한 것은 46개였으며, 총 형성된 band의 수는 158개로 나타났다. Band를 형성한 primer와 band를 형성하지 않은 primer간의 GC content를 비교하면 band를 형성한 primer의 경우 GC content는 평균 67.
그러나 본 실험에서는 오히려 45℃보다 37℃에서 더 양호한 band가 형성되어 딸기 DNA의 경우에는 37℃가 좋은 것으로 사료되었다. 즉, template DNA의 함량이 50ng, primer 농도는 l0pmol, annealing 온도는 37 ℃, 증폭회수는 45회로 하여 PCR을 수행하였을 때 가장 양호한 결과를 나타내었다(Fig. 4).
1). 즉, 추출한 DNA를 1% agarose gel 상에서 전기영동하여 ethidium bromide로 염색한 후 UV transilluminator 상에서 DNA band를 관찰한 결과 30-40Kb의 genomic DNA가 단일 밴드로 나타났다 (Fig. 1-B). 그러나 이 경우에는 추출한 DNA로부터 단백질이나 RNA에 의하여 오염이 되었기 때문에 추출한 DNA를 다시 RNase와 proteinase-K로 처리하였던 바, 매우 깨끗하고 순수한 DNA band를 확인 할 수 있었다(Fig.
4와 같다. 총 90 개의 primer 중에서 딸기 genomic DNA에서 PCR product를 형성한 것은 46개의 primer였으며, 총 형성된 band의 수는 158개로 나타났다(Table 1). Band를 형성한 primer와 band를 형성하지 않은 primer간의 GC content를 비교하면 band를 형성한 primer의 경우 GC content는 평균 67.
위하여 수행하였다. 추출한 딸기커(ㅊ)잣 DNA를 proteinase-K나 RNase-H를 처리하였을 때 깨끗하고 순수한 DNA band를 확인할 수 있었으며, 50ng의 template DNA, lOpmol의 primer, 37℃ annealing 온도로 45 cycle로서 PCR을 행하는 것이 가장 효율적이었다. 상기 실험 결과로서 PCR 적정 조건을 확립 한 후, UBC primer를 대상으로 딸기 여봉 DNA에서 PCR를 수행하여 RAPD의 양상을 조사한 결과 총 90개의 primer 중에서 딸기 genomic DNA에서 PCR product를 형성한 것은 46개였으며, 총 형성된 band의 수는 158개로 나타났다.
후속연구
2-B), 이보다 낮은 농도에서는 거의 band를 관찰할 수 없었다. 따라서 딸기의 PCR을 위해서 primer농도는 10pmol을 사용하는 것이 효과적인 것으로 생각되었으나, 이보다 높은 농도에서도 좀 더 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
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