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문제 정의
- 따라서 본 연구는 인삼 육성계통 callus의 기내배양에 의해서 항암물질을 대량으로 생산하기 위한 연구의 일환으로 우선 인삼 배양세포에서 poly acetylene 의 생성여부를 조사하고, 생합성을 위한 배양조건을 조사하였던 바, 그 결과를 이에 보 고하는 바이다.
- 따라서 기내배양에 의해서 polyacetylene을 대량 으로 생산하기 위해서는 새로운 고함유 세포주의 선발과 배 양조건을 달리함으로써 고생산 조건을 구명해야 할 것으로생각된다. 본 실험은 여러 인삼계통의 callus 세포군에서 poly acetylene 이 비교적 많이 함유된 세포군을 일차적으로 선발하고, 선발된 세포군에서 다시 단세포주를 선발하여 최종 적으로 고정된 세포주를 얻기 위한 기초자료를 획득하기 위해서 수행한 실험이다. 따라서 비교적 polyacetylene이 많이 검출된 계통번호 30201에서 유기된 callus를 대상으로 새로운 고정화된 세포주를 찾는다면 대량생산이 가능할 것으로 사료되며, 아직 30201 callus 세포군은 세포주라기보다는 여러 세포가 혼재되어 있는 세포군 상태이므로 추후 단세포로 선발하여 이 중에서 다시 poly acetylene 이 많이 함유된 세포 주를 고정하여 경제성을 분석한 후 산업화되어야 할 것으로 생각된다.
제안 방법
- Sucrosee] 효과를 조사하기 위해서 CPA 2 mg/L에 sucrose 농도를 10, 20, 30, 40, 50 "L로 첨가된 MS 배지에인삼 callus를 접종하여 배양하였으며, 또한 배지종류별 효과를 조사하기 위해서 Schenk and Hildebrandt (SH)와 MS배 지에 CPA를 2 mg/L 첨가하여 배 양하였다
- TLC 에 의해서 poly acetylene0] 검출된 처리구에서 GC 로 함량을 측정하였다. 인삼 callus에서 polyacetylene의 추출은 냉동건조된 callus 200 mg를 MeOH로 6시간씩 3회 환류 추출하여 감압농축하였다.
- 0 mg/L씩 각각 추가 첨가하여 callus를 접종하고, 배양 30일 후 생장량과 polyacetylene 검출 여부를 TLC로 조사하였다. 또한 naphthalene acetic acid (NAA)의 효과를 조사하기 위해서는 동 일 배지에 NAA만 0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 mg/L씩 각각 첨가하여 조사하였으며, 25±2℃의 배양실에서 16시간의 일장 에서 광조건으로 배양하였다.
- 인삼 callus 의 생장과 poly acetylene 의 생합성에 미치는 6・ benzylaminopurine (BA)의 효과를 조사하기 위해서 MS배 지에 ^3-chlorophenoxyacetic acid (CPA) 를 2 mg/L 첨가한 후 BA의 농도를 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 mg/L씩 각각 추가 첨가하여 callus를 접종하고, 배양 30일 후 생장량과 polyacetylene 검출 여부를 TLC로 조사하였다. 또한 naphthalene acetic acid (NAA)의 효과를 조사하기 위해서는 동 일 배지에 NAA만 0, 0.
- 인삼 callus로부터 polyacetylene 함유 여부를 신속히 확인 하여, 확인된 callus를 gas chromatogram (GC)에 적용하기 위해서 thin layer chromatogram (TLC)방법에 의해서 poly acetylene 의 검출 여부를 조사하였다. 냉동건조된 인삼 callus 0.
- TLC 에 의해서 poly acetylene0] 검출된 처리구에서 GC 로 함량을 측정하였다. 인삼 callus에서 polyacetylene의 추출은 냉동건조된 callus 200 mg를 MeOH로 6시간씩 3회 환류 추출하여 감압농축하였다. 농축액을 물에 녹인후 석유 에텔 : 에 텔 (4 : 1)로 추출해서 석유에텔층을 무수 Na2SO4로 탈수시 키고 Whatman #41 paper에서 여과한 후 다시 1 ml로 농축 하여 GC에 적용하였다.
- 인삼 callus의 기내배양에 의해서 항암물질을 대량생산하기 위한 연구의 일환으로 인삼 우수계통으로부터 기내에서callus를 유기하여 polyacetylene 고함유 세포주를 선발하고, 인삼 callus의 polyacetylene 생산에 미치는 식물호르몬 및 배지으 영향을 조사하였다. 식물호르몬 CPA가 첨가된 MS배지에서 유도된 인삼 우수계통 callus에서는 polyacetylene 중 애서 panaxynole TLC와 GC에 의해서 전혀 검출할 수 없 었으나, callus에 따라서는 panaxydol이 형성됨을 확인할 수 있었다.
- 인삼 계통 10301 callus는 CPA만 첨가된 배지에서는 전혀 poly acetylene 이 검출되지 않는 세포주이지만 (Table 2), 다른 식물호르몬이 첨가된 배지를 이용하여 poly acetylene 의 생성을 유도하고자 인삼 callus의 생장에 가장 좋은 CPA농 도조건 (Yang et al. 2000c) 에 BA와 NAA를 농도별로 각각혼합 첨가하여 배양하였다. 우선 BA의 효과를 조사하기 위해서 CPA 2 mg/L 첨가된 배지에 BA 농도별 생장량과 polyacetylene 생성을 조사한 결과, BA 0.
- 한국인삼연초연구원에서 순계 분리하여 고정화하고 있는 인삼 육성계통별 (Yang et al. 2000)로 polyacetylene 고함 유 세포주를 선발하기 위해서 CPA (j3-chiorophenoxy acetic acid) 2 mg/L 첨가된 Murashige and Skoog (MS)배지에서 유기된 계통별 callus로부터 TLC를 이용하여 polyacetylene의 함량을 조사하였다.
대상 데이터
- 5 g을 석유에텔과 에텔이 4 : 1로 혼합된 용매에서 15시간 추출, 다시 농축한 후 동용매 500 uL로 희석하여 그 중 50 uL를 TLC에 적용하였다. TLC 전개용매는 석유에텔과 에텔이 8 : 2로 혼합된 용매를 사용하였으며, 전개 후 anisaldehyde sulfuric acid로 발색 시켰다.
성능/효과
- 같은 Panax gmseng이지만 일본에서 재배되고 있는 종을 국내에서 재배한 JY104의 경우에도 panaxydol0] 검출되었다 (Table 1). Panaxydole 매우 강력한 항암효과를 나타내며(Matsunaga et al. 1994), 아직 인삼 callus에서는 검출된 보고가 없지만, 본 실험결과 인삼 callus에서도 panaxydol0] 생성되고 있음을 TLC를 통해서 성공적으로 검출할 수 있었다. 또한 인삼 callus는 아니지만 기내배양기에서 뿌리의 형태로 생장되는 인삼모상근에서는 panaxydol0] 생성되고 있음이 이미 보고 조었고, 여기에서 추출된 panaxydol쥐의 간 ACAT을 억 제하는 효과가 있음을 보고한 바 있다.
- Panaxydol이 형성된 인삼 callus 중에서 계통번호 20601, 30101., 30201, Y0301, JY104 및 포장에서 재배된 인삼뿌리 틀 대상으로 하여 다시 GC 로 poly acetylene 의 정확한 함량 을 조사한 결과 (Table 2), 30201에서 0.201 mg/g로 가장 많검출되었으며, 다소 적긴하지만 TLC에서 나타난 바와 같이 20601 (0.169 mg/g)과 JY104 (0.168 mg/g)에서도 생성되았으며 또한 30101과 Y0301 에서도 모두 검출되었다. 그러나 인삼뿌리에서 형성된 1.
- Table 3에서 TLC 분석결과 계통번호 10301callus 세포주 의 경우에는 CPA 단독처리구에서 poly acetylene0] 전혀 형 성되지 않았으나, BA처리구에서는 polyacetylene 검출이 확 인되었으므로, GC에 의해서 정량하고자 함량을 조사하였던바, BA를 처리하지 않은 배양기에서는 polyacetylerie이 거의 검출되지 않았지만 BA처리구에서는 0.149 mg/g가 검출되어 (Table 4), 추후 CPA 단독처리 배지에서도 poly acetylene0] 형성된 계통번호 30201 callus 세포주를 BA첨가 배지에서 배 양하면 poly acetylene 의 함량을 증가시킬 수 있을 것으로 생 각된다
- 특히 30201에서는 TLC결과 panaxydol의 spot가 매우 크게 나타났으나, 포장에서 재배된 인삼 뿌리에서 비하면 매우 적게 나타났다. 계통별로 차이를 보면 공시한 Panax ginseng 자경종11 종 중 3종에서 panaxydol이 검출되었으며, 황숙종에서는 4 종 중 1종에서 panaxydol이 형성되었다. 같은 Panax gmseng이지만 일본에서 재배되고 있는 종을 국내에서 재배한 JY104의 경우에도 panaxydol0] 검출되었다 (Table 1).
- 또한 CPA 단독 처리구에서는 전혀 생성되지 않은 polyacetylene 중 panaxydol 이 BA처리구에서는 모두 검출되는 경향을 보였다. 그러나 BA의 농도가 증가하여도 panxydol의 함량은 증가되지 않았으며 역시 인삼뿌리에서는 검출되는 panaxynole 전혀 검출되지 않았고 검출된 panaxydol의 함량도 인삼뿌리에 비하면 매우 적은 양이 검출되었다 (Table 4).
- 따라서 본 연구는 nitric oxide synthase에 의해서 nitrite의 섇성의 저해작용을 하며 (Wang et al. 2000), L1210 암세포에 강력한 cytotoxity를 갖는 panaxydiol (Matsunaga et al.2000) 을 기내 배양에 의해서 생산할 수 있음을 입증하였으며, 가종 인삼 선발계통으로부터 활성물질의 농도가 높은 세포주 를 기내에서 선발할 수 있는 가능성을 시사하였고, 특히 여러 7.지 배양조건에 따라서 panaxydol을 성공적으로 생산할 수 있음을 제시하였다.
- 032 mg/L에 비해 절반 이상이 감소되는 경향을 보였다 (Table 3). 또한 CPA 단독 처리구에서는 전혀 생성되지 않은 polyacetylene 중 panaxydol 이 BA처리구에서는 모두 검출되는 경향을 보였다. 그러나 BA의 농도가 증가하여도 panxydol의 함량은 증가되지 않았으며 역시 인삼뿌리에서는 검출되는 panaxynole 전혀 검출되지 않았고 검출된 panaxydol의 함량도 인삼뿌리에 비하면 매우 적은 양이 검출되었다 (Table 4).
- 인삼 callus의 기내배양에 의해서 항암물질을 대량생산하기 위한 연구의 일환으로 인삼 우수계통으로부터 기내에서callus를 유기하여 polyacetylene 고함유 세포주를 선발하고, 인삼 callus의 polyacetylene 생산에 미치는 식물호르몬 및 배지으 영향을 조사하였다. 식물호르몬 CPA가 첨가된 MS배지에서 유도된 인삼 우수계통 callus에서는 polyacetylene 중 애서 panaxynole TLC와 GC에 의해서 전혀 검출할 수 없 었으나, callus에 따라서는 panaxydol이 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히, 강력한 항암효과를 가지고 있는 panaxydole 으계통 callus 18종 중에서 5종이 형성하였으며, 30201계통 callus에서 가장 많이 검출되었다.
- 2000c) 에 BA와 NAA를 농도별로 각각혼합 첨가하여 배양하였다. 우선 BA의 효과를 조사하기 위해서 CPA 2 mg/L 첨가된 배지에 BA 농도별 생장량과 polyacetylene 생성을 조사한 결과, BA 0.05 mg/L 처리에서 생장이 가장 양호하였으며, 그 이상에서는 농도가 증가할수록 callus 생체중이 감소하는 경향을 보였고, BA 2 mg/L 이상에 서는 생체중이 5.642 g/flask로서 BA 0.05 mg/L 처리구의 11.032 mg/L에 비해 절반 이상이 감소되는 경향을 보였다 (Table 3). 또한 CPA 단독 처리구에서는 전혀 생성되지 않은 polyacetylene 중 panaxydol 이 BA처리구에서는 모두 검출되는 경향을 보였다.
- 인삳 callus의 생장 및 polyacetylene 생성에 적합한 배지 를 조사한 결과 기존에 사용한 MS배지보다 SH배지가 인삼 callus의 생장에 더 양호하였으며, 특히 SH배지에서는 pan- axydol이 약간 검출되었다 (Table 7).
- 05 mg/L 첨가구에 서는 callus의 생장도 양호하였으며, panaxydol도 생성하였다. 인삼 callus의 생장과 panaxydol의 합성에는 MS배지보다 SH배지가 더 양호하였으며, NAA와 sucrose는 전혀 영향을 미치지 않았다.
- 인삼 callus의 생장과 polyacethylene 생산에 미치는 sucrose 효과를 조사하기 위해서 sucrose 농도를 10~50 mg/L까지 처 리하였던 바, 생장은 sucrose 30~40 mg/L처리 시 가장 양호하였으며, sucrose 20 mg/L 이하는 생장이 절반 쯤 감소되었고, sucrose 50 mg/L에서도 생장이 감소되였다 (Table 6). Polyacethylenee sucrose 농도에 관계없이 모든 처리구에서 전혀 검출되지 않았다.
- 인삼 육성계통별로 CPA 2 mg/L 첨가배지에서 유기된 callus 로부터 신속하고 간단하게 poly acetylene 의 검출 여부 를 조사하기 위해서 TLC로 확인한 결과 (Table 1), panaxy- nole 전혀 형성되지 않았으나, 계통번호 20601, 30101, 30201, Y0301, JY104에서는 panaxydol이 검출되었다. 특히 30201에서는 TLC결과 panaxydol의 spot가 매우 크게 나타났으나, 포장에서 재배된 인삼 뿌리에서 비하면 매우 적게 나타났다.
- 식물호르몬 CPA가 첨가된 MS배지에서 유도된 인삼 우수계통 callus에서는 polyacetylene 중 애서 panaxynole TLC와 GC에 의해서 전혀 검출할 수 없 었으나, callus에 따라서는 panaxydol이 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히, 강력한 항암효과를 가지고 있는 panaxydole 으계통 callus 18종 중에서 5종이 형성하였으며, 30201계통 callus에서 가장 많이 검출되었다. 또한 인삼 10301계통 callus는 CPA가 단독으로 첨가된 배지에서 panaxydol을 생 성하지 못하였으나, CPA 2 mg/L와 BA 0.
- 한편 인삼 mllus 생장과 polyacethylene생성에 미치는 NAA 효과를 구명하기 위해서 농도별로 NAA를 처리하여 배양한 결과 (Table 5), callus의 생장량은 NAA 농도가 증가할수록 점차 감소하는 경향을 보였으며, polyacetylenee panaxynol뿐만 아니라 panaxydol도 모든 처리구에서 검출되지 않았다.
후속연구
- 본 실험은 여러 인삼계통의 callus 세포군에서 poly acetylene 이 비교적 많이 함유된 세포군을 일차적으로 선발하고, 선발된 세포군에서 다시 단세포주를 선발하여 최종 적으로 고정된 세포주를 얻기 위한 기초자료를 획득하기 위해서 수행한 실험이다. 따라서 비교적 polyacetylene이 많이 검출된 계통번호 30201에서 유기된 callus를 대상으로 새로운 고정화된 세포주를 찾는다면 대량생산이 가능할 것으로 사료되며, 아직 30201 callus 세포군은 세포주라기보다는 여러 세포가 혼재되어 있는 세포군 상태이므로 추후 단세포로 선발하여 이 중에서 다시 poly acetylene 이 많이 함유된 세포 주를 고정하여 경제성을 분석한 후 산업화되어야 할 것으로 생각된다. 다만 일반적으로 생리활성물질은 CPA에서 생성이 어렵지만 배양조건 및 계통에 따라서는 차이가 있음을 확인할 수 있어 많은 인삼계통 등을 대상으로 하여 polyacetylene 고함유 세포주를 찾을 수 있을 것이다.
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