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문제 정의
- 본 연구는 담배 (Nicotiana tabacum L. cv. BY-4) 식물체의 공변세포 내의 엽록체수가 배수성을 검정하는 간이 지표 가 될 수 있는지를 검토하기 위하여 정상주와 약배양 유래 반수체, 반수체를 콜히 친 처리하여 얻어진 식물체 및 그 식물체의 후대 식물체를 사용하여 식물체 간의 배수성과 공변세포 내의 엽록체수의 상관관계를 조사하였다.
제안 방법
- 화분 발아 조사는 Park 등(1996)의 방법에 따라 수행하였다. 개화성기의 성숙한 꽃가루를 채취하여 화분 발아용용액(10% sucrose, 0.01% boric acid, 3 mM calcium nitrate) 에서 25℃, 4시간 동안 정치한 다음 광학현미경 (Olympus SZX12, Japan) 하에서 화분 발아가 이루어진 화분을 계수하여 백분율로 표시하였다.
- 표피조직위에 iodine-potassium iodide 용액[1% iodine (w/v), 2% (w/v) potassium iodide]을 한 방울 떨어뜨린 다음 cover glass를 덮고 검경하였다. 공변세포 내의 엽록 체 수는 3개체의 잎에서 10개의 세포 내의 엽록체수를 조사한 후 평균하여 산출하였다. 잎은 상위(2~3엽), 중위(5~6 엽), 하위(8~9엽)로 나누어 조사하였다.
- 담배 정상주 (Nicotiana tahacum L. cv. BY-4), 약 배양으로 유도시킨 반수체(2n=2x=24), 콜히 친 처리로 염색체를 배가한 식물체(2n=4x=48) 및 그 후 대식물체 (Fi)를 각각 사용하여 배수성에 따른 공변세포 내 엽록체수를 조사하였다 공변세포 내 엽록체의 수는 정상주에서 반수체의 2배로 배수성과 밀접한 관계를 나타내었다. 또한, 반수체를 콜히 친으로 배가시킨 식물체에서 공변세포 내 엽록체의 수는 반수체의 2배로 배수성이 회복됨에 따라 증가하였다.
- 약 배양은 담배 식물체로부터 화아의 크기가 11~13 mm 정도의 것을 채취하여 1 % sodium hypochlorite어)서 15분간 침적한 다음 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 멸균된 화아로부터 약을 분리하여 kinetin 1 mg/L, IAA 2 mg/L, 30 g/L sucrose 가 첨가되고 pH가 6.70으로 조정된 Nakata 배지 (Nakata and Kurihara 1972)에 치상하였다. 배양은 25±1℃, 연속광(30 /zmol .
- 상기 실험에서 배수성으로 판명된 재료들을 사용하여 재배환경이 다른 조건에서 자란 공변세포의 엽록체수를 조사하였다 (Table 3, 4). Pot에서 재배된 식물체의 경우 엽령에 따른 공변세포 내의 엽록체수는 2~3엽, 5~6엽, 8~9엽기 모든 생장단계에서 정상주의 경우 22.
- 식물체 간 배수성을 동정하고 자 기 내 배양 중인 식물체와 pot에서 재배 중인 식물체로부터 0.5 cm2 크기로 잎을 채취하여 0.25 ml의 HR-A 용액 (Partec 사)을 첨가하고 조직을 chopping하였다. 이 조직액을 30의 막 (partec CellTrics™)에 통과시킨 후 실온에서 5분간 방치하였다.
- 식물체의 형태적 특성으로 최대 엽장 폭비 (개화 2주 전 식물체)와 화기의 크기를 조사하였다. 화기의 크기는 만개한 꽃의 자방 밑부터 화판 끝까지의 길이, 화관 내부의 최대직경, 그리고 생중량을 조사하였다.
- 약 배양 과정을 통하여 재분화시킨 반수체 유식물체를 염색 체 배가를 위하여 약광하에서 0.02% 농도의 콜히친을 72시간 동안 뿌리에 침적 처리한 다음 멸균수로 2분간 3회 수세하였다. 이 식물체를 3일간 기내 조건과 유사한 환경에서 유지시킨 다음 pot에 이식하였다.
- 이 조직액을 30의 막 (partec CellTrics™)에 통과시킨 후 실온에서 5분간 방치하였다. 여기에 1.0 ml의 HR-B 용액 (Partec 사)을 첨가하여 염색한 다음 flowcyto- meter (Partec PA- H, Germany)를 사용하여 각 세포당 DNA함량을 측정하였다.
- 공변세포 내의 엽록 체 수는 3개체의 잎에서 10개의 세포 내의 엽록체수를 조사한 후 평균하여 산출하였다. 잎은 상위(2~3엽), 중위(5~6 엽), 하위(8~9엽)로 나누어 조사하였다.
- 배수성과 공변세포 내 엽록체수와 관련성을 검토하기 위해서는 배수성을 명확히 할 필요가 있다. 체세포 분열의 간기의 핵 DNA 함량을 측정하면 식물체의 배수성 정도를 판정할 수 있기 때문에 (Galbraith et al. 1983; de Laat et al. 1987), 정상주를 약배양하여 획득한 반수성 개체와 염색체배가제로 서 콜히 친을 처리하여 유도한 개체들의 배수성을 flowcyto- meter로 측정하여 정상주와 비교하였다. 공시재료의 세포당 DNA 함량으로써 배수성 패턴을 검토한 결과 (Table 1), Gi phase의 세포당 DNA 함량은 반수체가 정상주의 절반의 DNA량을 보였고, 콜히 친 처리에 따른 염색체 배가체와 그 후 대식물 (Fi)에서는 정상주와 비슷한 DNA 함량을 나타내었다.
- 잎의 이면을 분리하여 슬라이드 글라스 위에 올려놓고 이면 표피 부분만 오려내었다. 표피조직위에 iodine-potassium iodide 용액[1% iodine (w/v), 2% (w/v) potassium iodide]을 한 방울 떨어뜨린 다음 cover glass를 덮고 검경하였다. 공변세포 내의 엽록 체 수는 3개체의 잎에서 10개의 세포 내의 엽록체수를 조사한 후 평균하여 산출하였다.
- 식물체의 형태적 특성으로 최대 엽장 폭비 (개화 2주 전 식물체)와 화기의 크기를 조사하였다. 화기의 크기는 만개한 꽃의 자방 밑부터 화판 끝까지의 길이, 화관 내부의 최대직경, 그리고 생중량을 조사하였다.
대상 데이터
- cv. BY-4(2n=4x=48) 와 이 재료로부터 약배양하여 획득한 반수성식 물체(2n=2x=24), 반수체식물에 콜히친을 처리하여 염색체를 배가시킨 식물체(2n=4x=48) 및 배가 식물체의 R 식물체(2n=4x=48)를 이용하였다
- 공변세포의 엽록체수는 pot 또는 기내 배양식물체에서 채취한 잎 뒷면의 공변세포를 이용하였다. 잎의 이면을 분리하여 슬라이드 글라스 위에 올려놓고 이면 표피 부분만 오려내었다.
이론/모형
- 화분 발아 조사는 Park 등(1996)의 방법에 따라 수행하였다. 개화성기의 성숙한 꽃가루를 채취하여 화분 발아용용액(10% sucrose, 0.
성능/효과
- 1987), 정상주를 약배양하여 획득한 반수성 개체와 염색체배가제로 서 콜히 친을 처리하여 유도한 개체들의 배수성을 flowcyto- meter로 측정하여 정상주와 비교하였다. 공시재료의 세포당 DNA 함량으로써 배수성 패턴을 검토한 결과 (Table 1), Gi phase의 세포당 DNA 함량은 반수체가 정상주의 절반의 DNA량을 보였고, 콜히 친 처리에 따른 염색체 배가체와 그 후 대식물 (Fi)에서는 정상주와 비슷한 DNA 함량을 나타내었다. 따라서, 콜히 친으로 염색체를 배가시킨 계통과 그 후 대식 물은 정상 주 담배 식물체와 같은 4배체(2&=4x=48) 이고, 약배 양으로 유도한 식물체는 그 반수인 2배체(2n=2x=24)로 판명되었다.
- 1997; Mishiba and Mii 1997)된 배수성이 불안정한 것과는 다르게 공변세포 내 엽록체수의 변동이 매우 안정한 요소라는 것을 반증해준다. 그러므로, 공변세포 내 엽록 체 수는 BY-4 담배에 있어 배수성을 측정하는 데 신뢰할 만요소로 평가되었으며, 기내배양 중인 식물이라도 잎만 확보 하면 손쉽게 염색체의 배가 여부를 확인할 수 있다. 이러한 방법을 이용하면 polysomaty의 문제가 없는 한 다른 식물종에 대해서도 이의 적용이 가능할 것으로 보인다.
- 또한 반수체는 2n=24이고 콜히친으로 염색체 배가시킨 계통과 그 후대 식물에서는 2n=48임을 확인할 수 있었다. 따라서, 공시 재료는 배수성 관계를 유지하였고 본 실험의 재료에 사용하기에 적합하였다. 한편, 엽령에 따른 배수성을 판별한 결과, 유엽 인 상위엽의 Gi phase의 DNA 함량peak는 94.
- 기내 배양의 경우도 pot 재배시와 같이 배수성과 공변세포 내 엽록체수는 서로 밀접한 상관관계를 나타냈다 (Table 4). 따라서, 본 논문에 사용된 담배의 경우 재 배환경 차이에 따른 공변세포 내 엽록체수의 변화는 관찰되지 않았다.
- 공시재료의 세포당 DNA 함량으로써 배수성 패턴을 검토한 결과 (Table 1), Gi phase의 세포당 DNA 함량은 반수체가 정상주의 절반의 DNA량을 보였고, 콜히 친 처리에 따른 염색체 배가체와 그 후 대식물 (Fi)에서는 정상주와 비슷한 DNA 함량을 나타내었다. 따라서, 콜히 친으로 염색체를 배가시킨 계통과 그 후 대식 물은 정상 주 담배 식물체와 같은 4배체(2&=4x=48) 이고, 약배 양으로 유도한 식물체는 그 반수인 2배체(2n=2x=24)로 판명되었다. 또한 이러한 배수성 경향은 기내에서 재배시킨 식물체에서도 변함없이 안정하게 나타났다(자료 미제시).
- BY-4)는 AB 게놈이며 2n=48이라는 것이 이미 알려진 사실과 일치함을 확인하였다. 또한 반수체는 2n=24이고 콜히친으로 염색체 배가시킨 계통과 그 후대 식물에서는 2n=48임을 확인할 수 있었다. 따라서, 공시 재료는 배수성 관계를 유지하였고 본 실험의 재료에 사용하기에 적합하였다.
- 이것은 정상주가 반수체에 비해 2배의 엽록체수를 갖고 있다는 것을 시사한 것이다. 또한 반수체를 염색체배가시킨 식물체의 잎에서는 22.6±0.4~23.0±0.4개로 배수성이 증가함에 따라 공변세포 내 엽록체수도 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 증가는 Fi 세대에서도 유사하게 나타났다 (Table 3, Figure 3A—H).
- 이것은 정상주의 화분발아 율 99%에 비해 약간 낮게 나타났으나 종자의 성숙에는 큰 문제가 없었다. 또한 이 배체 후 대식물의 화분 발아율도 약 92% 정도로 관찰되었다.
- BY-4), 약 배양으로 유도시킨 반수체(2n=2x=24), 콜히 친 처리로 염색체를 배가한 식물체(2n=4x=48) 및 그 후 대식물체 (Fi)를 각각 사용하여 배수성에 따른 공변세포 내 엽록체수를 조사하였다 공변세포 내 엽록체의 수는 정상주에서 반수체의 2배로 배수성과 밀접한 관계를 나타내었다. 또한, 반수체를 콜히 친으로 배가시킨 식물체에서 공변세포 내 엽록체의 수는 반수체의 2배로 배수성이 회복됨에 따라 증가하였다. 이 배체의 후대 식물에 서도 공변세포 내 엽록체의 수는 반수체의 2배로 나타났다.
- 배수체의 화분의 임성 특성을 조사하고 화분의 건전도를 평가하기 위하여 화분의 발아율을 검토한 결과 (Figure 2A, B, C, D), 반수체는 화분의 발아가 전혀 관찰되지 않는 반면 콜히 친을 처리하여 염색체를 배가시킨 식물체에서는 약 91% 정도 화분의 발아율을 보여주었다. 이것은 정상주의 화분발아 율 99%에 비해 약간 낮게 나타났으나 종자의 성숙에는 큰 문제가 없었다.
- 이상의 결과는 BY-4 담배의 반수체와 이수체 간에 있어서 공변세포 내 엽록체의 수는 배수성 변화에 매우 밀접하게 관련되어 있고 엽령과 기내외 재배환경의 차이에 따라서도 변동되지 않으며, 또한 배수성 증가에 따른 공변세포 내의 엽록 체 수가 후대에서도 안정하게 유지됨을 확인하였다. 따라서 BY-4 담배의 경우 타 식물체에서 보고 (Galbraith et al.
- 이상의 결과를 종합하면 BY-4 담배에서 2배체와 4배체의 배수성 판별은 공변세포 내의 엽록체수를 조사하는 것으로 근딘히 가능하다. 또한 이 방법은 매우 간단한 방법이기 때문에 간이로 배수성만을 검토하고자 할 때, 고가 장비의 설치와 분석 비용이 필요한 flow cytometry 방법보다 손쉽게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 또한 이러한 배수성 경향은 기내에서 재배시킨 식물체에서도 변함없이 안정하게 나타났다(자료 미제시).이와 같이 flow cytometry 분석으로 정상주 담배 식물체 (Nicotians tabacum L. cv. BY-4)는 AB 게놈이며 2n=48이라는 것이 이미 알려진 사실과 일치함을 확인하였다. 또한 반수체는 2n=24이고 콜히친으로 염색체 배가시킨 계통과 그 후대 식물에서는 2n=48임을 확인할 수 있었다.
- 따라서, 공시 재료는 배수성 관계를 유지하였고 본 실험의 재료에 사용하기에 적합하였다. 한편, 엽령에 따른 배수성을 판별한 결과, 유엽 인 상위엽의 Gi phase의 DNA 함량peak는 94.30, 오래된 잎 인 하위엽은 99.68로 서 상위엽(2엽)과 하위엽(8엽) 간에 배수성 패턴은 차이가 없었다.
- 2 mm보다 작았다. 화경도 반수체에서 작게 관찰되었으며, 또한 꽃의 생중량도 반수체가 정상주에 비해서 46.4% 정도의 중량을 보였고, 콜히 친 처리로 염색체가 배가된 식물체는 정상주보다 약간 무겁게 측정되었다 (Table 2). 그 외 배가된 식물체와 그 Ft 식물체에서 꽃의 길이는 대체로 정상 주보다 약간 짧지만화경은 약간 크게 나타났다 (Figure 1C, D, E, F).
후속연구
- 기내에서 생장한 식물체에서 공변세포 내 엽록체의 수는 pot 재배식물체와 비슷한 결과를 나타내었다. 따라서 잎의 공변세포 내기공수는 배수성을 간단하게 판정하는데 이용할 수 있을 것으로 보인다.
- 담배의 경우 기내 외 환경조건 및 엽령에 따른 공변세포 내의 엽록체수와 배수성의 상관에 대한 자세한 연구결과는 거의 보고되지 않고 있다. 따라서, 공변세포 내의 엽록체수를 배수성을 판별하는 지표로 활용하기 위해서는 이에 대한 보다 구체적인 검토가 필요하다.
- 이상의 결과를 종합하면 BY-4 담배에서 2배체와 4배체의 배수성 판별은 공변세포 내의 엽록체수를 조사하는 것으로 근딘히 가능하다. 또한 이 방법은 매우 간단한 방법이기 때문에 간이로 배수성만을 검토하고자 할 때, 고가 장비의 설치와 분석 비용이 필요한 flow cytometry 방법보다 손쉽게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 그러므로, 공변세포 내 엽록 체 수는 BY-4 담배에 있어 배수성을 측정하는 데 신뢰할 만요소로 평가되었으며, 기내배양 중인 식물이라도 잎만 확보 하면 손쉽게 염색체의 배가 여부를 확인할 수 있다. 이러한 방법을 이용하면 polysomaty의 문제가 없는 한 다른 식물종에 대해서도 이의 적용이 가능할 것으로 보인다.
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