[논문]적은 수의 거대 엽록체를 가진 핵 형질전환 식물체를 이용한 담배 엽록체 형질전환 빈도 제고

정원중; 민성란; 유장렬

doi:10.5010/jpb.2007.34.3.271

적은 수의 거대 엽록체를 가진 핵 형질전환 식물체를 이용한 담배 엽록체 형질전환 빈도 제고
Enhancement of Chloroplast Transformation Frequency by Using Mesophyll Cells Containing a Few Enlarged Chloroplasts from Nuclear Transformed Plants in Tobacco 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.34 no.3, 2007년, pp.271 - 275

정원중 (한국생명공학연구원 식물유전체연구센터) , 민성란 (한국생명공학연구원 식물유전체연구센터) , 유장렬 (한국생명공학연구원 식물유전체연구센터)

초록
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엽록체 형질전환된 식물체를 얻으려면 먼저 세포수준에서 모든 엽록체가 형질전환되어야 하는데, 세포내에는 많은 수의 엽록체가 존재하므로, 엽록체 형질전환 벡터가 전이되어 형질전환된 엽록체는 선발배지에서 선택적으로 분열을 계속하고 형질전환되지 않은 엽록체들은 분열을 하지 못하게 되어, 결국 해당 세포내의 모든 엽록체가 형질전환된 상태에 이르게 된다. 따라서 만일 해당 세포내에 엽록체의 수가 적으면 그만큼 효율적으로 엽록체 형질전환을 할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 담배의 FtsZ 유전자를 핵형질전환법으로 과잉 발현시킴으로써 엽록체의 분열이 저해되어 엽육세포내에 거대한 엽록체 3-5개를 가진 담배식물체의 엽육조직을 이용하여, 엽록체 형질전환을 한 결과, 엽록체 형질전환 빈도가 약 40% 증가되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

In the chloroplast transformation process, a chloroplast containing transformed chloroplast genome copies should be selected over wild-type chloroplasts on selection medium. It is more effective for a cell to become homoplasmic if the cell contains smaller number of chloroplasts. Therefore, to reduce the number of chloroplasts in mesophyll cells in tobacco, we overexpressed FtsZ to generate transgenic plants, of which mesophyll cell contained a few enlarged chloroplasts contrast to a wild-type mesophyll cell containing approximately 100 chloroplasts. It was demonstrated that transgenic leaf tissues comprising cells with a few enlarged chloroplasts gave rise to approximately 40% higher frequency of chloroplast-transformed adventitious shoots.

AI 본문요약
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문제 정의

그러므로 만일 엽록체 수가 획기적으로 줄어든 핵형질전환된 엽육조직을 이용하여 엽록체 형질전환을 한다면, 엽록체 형질전환시스템의 가장 큰 문제점 중의 하나인 형질전환 빈도를 제고할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 FtsZ 유전자를 과잉 발현시킨 담배식물체의 엽육조직을 이용함으로써 엽록체형 질전환의 빈도를 제고 코자 하였다.
본 연구에서는 GFP가 발현된 거대 엽록체를 이용하여 효율적인 엽록체 형질전환 시스템을 개발하였다. 현재 엽록체 형질전환 기술은 그 사용이 제한 되어있어서, 대부분의 연구가 담배에서 이루어져 있는데, 이는 엽록체 형질전환 효율의 제고를 통해서 해결될 수 있을 것이다.

제안 방법

형질전환 유무는 UV 및 PCR 방법으로 확인하고 growth chamber에서 생육시켜 종자를 수확하였다. Bombarding 횟수 당 형질전환된 adventitious shoot의 수를 조사하여 형질전환 빈도를 분석하였다.
He- teroplasmy 및 chimera를 제거하기 위하여 spectinomycin 에 저항성을 가지는 shoot을 1-3 mm 크기의 절편으로 나누어 2 차 선발과정을 진행하였다. 이후 발생한 shoot을 생장조절제가 첨가되지 않고 500 mg/L spectinomycin이 첨가된 MS 배지에서 뿌리를 유도하였다.
엽록체 형질전환벡터는 CtV2 (Guda et al. 2000)를 backbone으로 하고 aadA 유전자 뒤쪽의 Xbal site에 ribosome binding site 및 GFP 유전자를 연결하여, 기존에 본 연구실에서 제작한 aadA와 GFP의 dicistronic expression을 위한 TIG 벡터(Jeong et al. 2004)와 동일한 구조를 가지도록 제작하였다. 엽록체 형질전환은 Jeong 등(2004)의 방법에 준하였다
이후 발생한 shoot을 생장조절제가 첨가되지 않고 500 mg/L spectinomycin이 첨가된 MS 배지에서 뿌리를 유도하였다. 형질전환 유무는 UV 및 PCR 방법으로 확인하고 growth chamber에서 생육시켜 종자를 수확하였다. Bombarding 횟수 당 형질전환된 adventitious shoot의 수를 조사하여 형질전환 빈도를 분석하였다.
형질전환을 수행하여 배양 4주 후부터 관찰하여 spec- tinomycin에 저항성을 보이며 발생한 shoot을 잠정적인 엽록체 형질전환체로 추정하고 2차 선발을 수행하였다. He- teroplasmy 및 chimera를 제거하기 위하여 spectinomycin 에 저항성을 가지는 shoot을 1-3 mm 크기의 절편으로 나누어 2 차 선발과정을 진행하였다.
효율적인 선발을 위하여 reporter 유전자로 GFP를 가지는 엽록체 형질전환 벡터 CtVG를 제작하였다 (Figure 1). 엽록체 형질전환벡터는 CtV2 (Guda et al.

대상 데이터

담배 (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) FtsZ 유전자의과잉 발현에 의해 거대엽록체를 가지는 담배 식물체(Jeong et al. 2002a, b)의 기내발아된 유식물체의 잎을 엽록체 형질전환 재료로 사용하였다.

이론/모형

2004)와 동일한 구조를 가지도록 제작하였다. 엽록체 형질전환은 Jeong 등(2004)의 방법에 준하였다

성능/효과

대조구의 담배잎은 51회의 엽록체 형질전환 시도 (bombardment)에서 11 개체의 형질전환체를 확보하여 형질전환 빈도는 21.6%로 나타났고, 거대엽록체를 가지는 경우에는 47회의 형질전환시도에서 14개체의 형질 전환식물 체를 확보하여 형질전환 빈도는 29.8%로 나타났다.
2004). 또한 엽록체 형질전환을 이용하면 핵에 유전자를 도입한 것보다 이론적으로는 최대 5,000배 이상의 높은 발현이 가능하다. 다양한 연구결과에서 외래유전자의 발현이 획기적으로 높아짐이 보고됨으로써 (De Cosa et al.
따라서 만일 해당 세포내에 엽록체의 수가 적으면 그만큼 효율적으로 엽록체 형질전환을 할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 담배의 FtsZ 유전자를 핵 형질 전환법으로 과잉 발현시킴으로써 엽록체의 분열이 저해되어 엽육 세포 내에 거대한 엽록체 3-5개를 가진 담배식물체의 엽육조직을 이용하여, 엽록체 형질전환을 한 결과, 엽록체 형질전환 빈도가 약 40% 증가되었다.
엽록체 형질전환 효율은 wild type에 비하여 거대 엽록체를 가지는 경우 엽록체 형질전환 효율에서 약 40%의 증가를 나타냈다. 대조구의 담배잎은 51회의 엽록체 형질전환 시도 (bombardment)에서 11 개체의 형질전환체를 확보하여 형질전환 빈도는 21.
이 식물체는 spectinomycin 배지에서 정상적으로 뿌리가 발생하였으며 growth chamber 에서 정상적으로 생육하고 개화하였다. 이러한 형질전환 식물체의 세포를 현미경으로 다시 관찰하여 GFP가 정확히 엽록체에서 발현되고 있음을 확인하였다 (Figure 2).

후속연구

Jeong 등 (2002a, b)은 담배의 FtsZ 유전자를 핵 형질 전환법으로 과잉 발현시켰을 때 엽록체의 분열이 저해되어, wild type의 엽육세포 내에 작은 크기의 엽록체 약 100 개가 존재하던 것을 거대한 엽록체 3-5개를 가진 담배 식물체를 생산할 수 있었다. 그러므로 만일 엽록체 수가 획기적으로 줄어든 핵형질전환된 엽육조직을 이용하여 엽록체 형질전환을 한다면, 엽록체 형질전환시스템의 가장 큰 문제점 중의 하나인 형질전환 빈도를 제고할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 FtsZ 유전자를 과잉 발현시킨 담배식물체의 엽육조직을 이용함으로써 엽록체형 질전환의 빈도를 제고 코자 하였다.
이러한 것은 형질전환 조건을 개선하면 형질전환 효율을 훨씬 더 높일 수 있음을 의미한다. 따라서 GFP 선발시스템 및 개선된 거대엽록체 형질전환 시스템을 이용하여 엽록체 형질전환 효율의 향상을 기대할 수 있을 것이다. 또한 거대엽록체를 가지는 식물체는 wild type에 비하여 생육이 느린 단점을 가진다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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