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문제 정의
- 본 실험에서는 bar 유전자의 GC content# 조절하여 인공으로 합성된 제초제 저항성 유전자인 PAT 유전자 (NCBI Accession No-A02774)를 상추에 도입코자 Agrobacterium timgfaciens를 이용한 형질전환을 시도하여 제초제 저항성 상추를 선발하였던 바, 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- Total RNA를 RNA 추출 kit (iNtRon)를 이용하여 추출하고 이를 Northern blot 운석에 사용하였다. 10 “g의 total RNA를 formaldehyde를 함유하는 1% agarose gel에서 선기영동한 다음 nylon membrane에 transfer 하였으며 32P로 labelling된 PAT유전 자를 probe로 이용하여 hybridization 시켜 분석하였다.
- 200 mg 의 고농도의 kanamycin이 첨가된 MS 배지에 leaf disk를 1 cm2 크기로 잘라 16시간 광주기로 배양하였다. Kanamycin에 대해 내성이 있는 것으로 확인된 식물체에 대해서는 유전자 분석 및 포장검정을 실시하였다.
- L 1 NAA와 1 mg . L-1 의 2ip, 3% sucrose, 0.2% gelrite를 첨가한 배지에서 2일간 공동배양하였다. 공동배양 후 자엽은 형질전환된 신초의 분화와 성장을 위해 50 mg .
- 항생제 첨가 배지에서 선발된 식물체는 유전자 도입 여부를 확인하기 위해 PCR (Perkin Eiymer)을 수행하였다. PCR 반응은 96℃에서 5분간 predenaturation한 후 96℃에서 30 초간 denaturation, 55 ℃ 에서 30초간 annealing, 72℃ 에서 2 분간 second-extension을 36회 반복한 후 72℃에서 15분간 post-extension하는 조건으로 하였고, PCR 산물은 1% agarose gel 전기영동으로 확인하였다. Total RNA를 RNA 추출 kit (iNtRon)를 이용하여 추출하고 이를 Northern blot 운석에 사용하였다.
- PCR 반응은 96℃에서 5분간 predenaturation한 후 96℃에서 30 초간 denaturation, 55 ℃ 에서 30초간 annealing, 72℃ 에서 2 분간 second-extension을 36회 반복한 후 72℃에서 15분간 post-extension하는 조건으로 하였고, PCR 산물은 1% agarose gel 전기영동으로 확인하였다. Total RNA를 RNA 추출 kit (iNtRon)를 이용하여 추출하고 이를 Northern blot 운석에 사용하였다. 10 “g의 total RNA를 formaldehyde를 함유하는 1% agarose gel에서 선기영동한 다음 nylon membrane에 transfer 하였으며 32P로 labelling된 PAT유전 자를 probe로 이용하여 hybridization 시켜 분석하였다.
- 상추 자엽의 kanamycin 내성은 50 mg • L‘에서 0%에 이르는 결과를 보였다 (data 미제시). 따라서 형질전환 과정을 거쳐 얻어진 상추 식물체의 엽절편을 잘라 200 mg • L，kanamycin 배지에서 내성 검정을 실시하였다. 배양 4주 후 형질전환된 개체의 잎은 초록색의 callus가 형성되는 반면 대조식물체의 잎은 고사하였다 (Figure 2).
- 형질전환하지 않은 대조 식물체와 형질전환 과정을 거쳐 얻어진 식물체 중 발근이 정상적이지 않은 식물체는 유전자의 증폭이 전혀 이루어지지 않았고 200 mg 의 고농도의 항생제에 저항성을 보인 형질전 환 식물체는 NPTH, GUS에 해당하는 700 bp와 515 bp에서 뚜렷한 밴드를 보여 유전자가 도입되었음이 확인되었다 (Figure 3A, B). 또한 이 개체에 대해서는 제초제 저항성 유전자의 도입 여부도 확인하기 위해 PAT 유전자에 대해 PCR 을 수행하였다. NPTU 유전자의 PCR 결과와 마찬가지로 형질전환 하지 않은 식물체에서는 유전자의 증폭이 이루어지지 않았고, NPTU 유전자가 도입된 모든 형질전환 식물체는 예상되는 크기인 371 bp 단편이 증폭되어 PAT 유전자가 상추 genome 내로 도입되었음이 확인되었다 (Figure 3C).
- 상추 genome 내로 NPTfl 및 GUS 유전자의 도입을 확인 하기 위해 PCR을 수행하였다. 형질전환하지 않은 대조 식물체와 형질전환 과정을 거쳐 얻어진 식물체 중 발근이 정상적이지 않은 식물체는 유전자의 증폭이 전혀 이루어지지 않았고 200 mg 의 고농도의 항생제에 저항성을 보인 형질전 환 식물체는 NPTH, GUS에 해당하는 700 bp와 515 bp에서 뚜렷한 밴드를 보여 유전자가 도입되었음이 확인되었다 (Figure 3A, B).
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형질전환체의 선발
선발배지에서 유도된 신초는 형질전환체의 선발을 위해서 kanamycin에 대한 내성 여부를 검정하였다. 200 mg 의 고농도의 kanamycin이 첨가된 MS 배지에 leaf disk를 1 cm2 크기로 잘라 16시간 광주기로 배양하였다.
- 형질전환의 과정을 거쳐 얻어진 식물체에 대해서는 포트로 이식하여 약 4주간 생육시켜 안정된 활착과 생육을 확인한 후 제초제 저항성 검정을 실시하였다. 저항성 검정은 시판 제초제인 Basta 액제 (유효성분 18%, (주)경농)를 1500배액의 농도로 살포하여 형질전환체와 대조식물체의 생육을 관찰하였다.
- 항생제 첨가 배지에서 선발된 식물체는 유전자 도입 여부를 확인하기 위해 PCR (Perkin Eiymer)을 수행하였다. PCR 반응은 96℃에서 5분간 predenaturation한 후 96℃에서 30 초간 denaturation, 55 ℃ 에서 30초간 annealing, 72℃ 에서 2 분간 second-extension을 36회 반복한 후 72℃에서 15분간 post-extension하는 조건으로 하였고, PCR 산물은 1% agarose gel 전기영동으로 확인하였다.
- 형질전환의 과정을 거쳐 얻어진 식물체에 대해서는 포트로 이식하여 약 4주간 생육시켜 안정된 활착과 생육을 확인한 후 제초제 저항성 검정을 실시하였다. 저항성 검정은 시판 제초제인 Basta 액제 (유효성분 18%, (주)경농)를 1500배액의 농도로 살포하여 형질전환체와 대조식물체의 생육을 관찰하였다.
대상 데이터
- 본 실험에는 독일 Hoechest사에서 인공합성한 제초제 저항성 유전자인 phosphinothrfcin acetyftransferase (PAT) gene을 사용하였다. 공시 균주는 선발 marker인 GUS-NPT H 유전자와 PAT 유전자가 재소합되어진 binary vector# 함유한 Agrobacterium tumefacieris strain MP90을 사용하였다. Agrobacteriume 28℃ 암상태에서 50 mg .
- 본 실험에는 독일 Hoechest사에서 인공합성한 제초제 저항성 유전자인 phosphinothrfcin acetyftransferase (PAT) gene을 사용하였다. 공시 균주는 선발 marker인 GUS-NPT H 유전자와 PAT 유전자가 재소합되어진 binary vector# 함유한 Agrobacterium tumefacieris strain MP90을 사용하였다.
- 상추 (Lactuca saliva L. cv. Green Skirt. 청치마) 종자는 70% 에탄올로 30초, 전착제를 함유한 1% NaOCl로 15분간 표면 살균한 후 3~4회 멸균수로 수세하여 생장조절제를 첨가하지 않은 MS배지에서 발아시켰으며, 4일 후 자엽만을 절단하여 형질전환을 위한 공동배양에 사용하였다.
성능/효과
- 또한 이 개체에 대해서는 제초제 저항성 유전자의 도입 여부도 확인하기 위해 PAT 유전자에 대해 PCR 을 수행하였다. NPTU 유전자의 PCR 결과와 마찬가지로 형질전환 하지 않은 식물체에서는 유전자의 증폭이 이루어지지 않았고, NPTU 유전자가 도입된 모든 형질전환 식물체는 예상되는 크기인 371 bp 단편이 증폭되어 PAT 유전자가 상추 genome 내로 도입되었음이 확인되었다 (Figure 3C). PCR결과 PAT 유전자의 도입이 확인된 개체에 대해서는 Northern blot 검정을 통해 제초제 저항성 유전자가 안정적으로 발현됨을 확인하였다 (Figure 4).
- 이식 2주경에 뿌리가 안정적으로 활착하였으며 대조구와 비교하여 정상 적인 생육을 보였다. PAT 유전자 발현 검정을 위해 이식 4주 후 시판 제초제인 Basta를 1500배액의 농도로 충분히 살포한 결과 제초제 처리 3일 후부터 대조식물체는 활력을 잃으면서 잎이 말리는 현상을 보이다가 10일경에 완전히 고사한데 비해, 형질전환 식물체에서는 아무런 저해를 받지 않고 왕성한 생육을 유지하였다 (Figure 5). 제초제에 영향을 받지 않고 살아남은 개체는 5개월 후 정상적으로 추대 및 개화하여 유전자 도입이 추대 및 개화에 영향을 미치지 않음이 확 인되었다.
- NPTU 유전자의 PCR 결과와 마찬가지로 형질전환 하지 않은 식물체에서는 유전자의 증폭이 이루어지지 않았고, NPTU 유전자가 도입된 모든 형질전환 식물체는 예상되는 크기인 371 bp 단편이 증폭되어 PAT 유전자가 상추 genome 내로 도입되었음이 확인되었다 (Figure 3C). PCR결과 PAT 유전자의 도입이 확인된 개체에 대해서는 Northern blot 검정을 통해 제초제 저항성 유전자가 안정적으로 발현됨을 확인하였다 (Figure 4). 공동배양에 사용한 절편체대한 형질전환 개체의 비율은 2%로 South Bay' 품종을 재료로 한 Torres 등 (1987)의 3~6%보다는 다소 떨어지는 결과를 보였다.
- 발 근 배지로 옮겨진 신초 중 50%는 뿌리가 전혀 유도되지 않거나 뿌리의 발달이 정상적이지 못하였으며 이 개체는 이후의 PCR 반응에서 형질전환 되지 않는 개체임이 확인되었다. 따라서 항생제 배지에서의 발근 및 뿌리의 성장 확인을 통해 형질전환체를 선발하는 것이 가능할 것으로 사료되었다.
- 1998)에 따라 본엽 4매 이상으로 성장한 신초는 25 mg • L1 로 kanamycin의 양을 줄인 배지에서 발근을 유도하였다. 발 근 배지로 옮겨진 신초 중 50%는 뿌리가 전혀 유도되지 않거나 뿌리의 발달이 정상적이지 못하였으며 이 개체는 이후의 PCR 반응에서 형질전환 되지 않는 개체임이 확인되었다. 따라서 항생제 배지에서의 발근 및 뿌리의 성장 확인을 통해 형질전환체를 선발하는 것이 가능할 것으로 사료되었다.
- PAT 유전자 발현 검정을 위해 이식 4주 후 시판 제초제인 Basta를 1500배액의 농도로 충분히 살포한 결과 제초제 처리 3일 후부터 대조식물체는 활력을 잃으면서 잎이 말리는 현상을 보이다가 10일경에 완전히 고사한데 비해, 형질전환 식물체에서는 아무런 저해를 받지 않고 왕성한 생육을 유지하였다 (Figure 5). 제초제에 영향을 받지 않고 살아남은 개체는 5개월 후 정상적으로 추대 및 개화하여 유전자 도입이 추대 및 개화에 영향을 미치지 않음이 확 인되었다.
- 상추 genome 내로 NPTfl 및 GUS 유전자의 도입을 확인 하기 위해 PCR을 수행하였다. 형질전환하지 않은 대조 식물체와 형질전환 과정을 거쳐 얻어진 식물체 중 발근이 정상적이지 않은 식물체는 유전자의 증폭이 전혀 이루어지지 않았고 200 mg 의 고농도의 항생제에 저항성을 보인 형질전 환 식물체는 NPTH, GUS에 해당하는 700 bp와 515 bp에서 뚜렷한 밴드를 보여 유전자가 도입되었음이 확인되었다 (Figure 3A, B). 또한 이 개체에 대해서는 제초제 저항성 유전자의 도입 여부도 확인하기 위해 PAT 유전자에 대해 PCR 을 수행하였다.
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