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문제 정의
- 본 연구는 국내에서 수집된 왕포아풀 자생종의 형질 전환육종에 적용할 수 있는 배발생 조직배양 방법을 개발하기 위하여 수행되었다.
제안 방법
- 수확해 사용하였다. 70% ethyl alcohol에서 [ 분, 0.5% sodium hypochlorite 용액에서 15분간 진탕 처리한 후 3회 이상 멸균수로 세척하여 표면 멸균하였고, 미숙화서가 발달하고 있는 줄기를 채취하여 70% ethyl alcohol에서 30초, 0.5% sodium hypochlorite 용액에서 10분간 표면 살균한 후 clean bench에서 미숙화서를 적출하여 배양에 이용하였다. 절편체들은 sucrose 30 g/L, Phytagel (Sigma, USA) 3 g/L와 2, 4-D 가 1 mg/L가 함유된 MS 배지를 50 ml 넣은 150x15 mm 페트리디쉬에 8개씩 절편체를 치상하였고 25°C 암상태의 항온 실에서 배양하였다.
- 사용하였다. Nassau- Cheri', Midnight 의 완숙종자와, Destiny', P129의 미숙화서를 절편체로 사용하였고 'Glade', P77은 완숙종자와 미숙화서를 사용하여 절편체에 따른 배 발생 캘러스의 형성률을 조사하였다. 미숙화서는 20이년 2월 27일부터 4월 27일까지 4회에 걸쳐 온실과 시험포에서 재배하며 형성된 길이 20 mm 이하의 미숙화서를 채취하여 절편 체로 사용하였으며, 계통 및 화뢰 채취시기별 배발생 캘러스의 형성률을 조사하였다.
- 각 계통들을 1x1 m의 시험구에 식재하고 시비는 일반적인 관리 수준 (3〜4회/년, 30〜40 g/n?/회, 18-18-18복비기준)으로 하였다. 관수는 자연 강우에 의존하였으며, 연 2〜3회 예초를 실시하였다.
- Nassau- Cheri', Midnight 의 완숙종자와, Destiny', P129의 미숙화서를 절편체로 사용하였고 'Glade', P77은 완숙종자와 미숙화서를 사용하여 절편체에 따른 배 발생 캘러스의 형성률을 조사하였다. 미숙화서는 20이년 2월 27일부터 4월 27일까지 4회에 걸쳐 온실과 시험포에서 재배하며 형성된 길이 20 mm 이하의 미숙화서를 채취하여 절편 체로 사용하였으며, 계통 및 화뢰 채취시기별 배발생 캘러스의 형성률을 조사하였다.
- 5% sodium hypochlorite 용액에서 10분간 표면 살균한 후 clean bench에서 미숙화서를 적출하여 배양에 이용하였다. 절편체들은 sucrose 30 g/L, Phytagel (Sigma, USA) 3 g/L와 2, 4-D 가 1 mg/L가 함유된 MS 배지를 50 ml 넣은 150x15 mm 페트리디쉬에 8개씩 절편체를 치상하였고 25°C 암상태의 항온 실에서 배양하였다. 모든 배양실험은 3회 이상 반복하였다.
- 치상 1주일 후부터 캘러스의 형성 여부를 조사하기 시작하였다. 유도된 캘러스는 3주 간격으로 동일한 배지에 계대 배양하였다.
- 유도된 배발생 캘러스 중 일부를 액체 캘러스 증식배지가 50 ml 첨가된 250 ml flask에서 100 rpm 속도로 회전진탕배 양하였으며 계대배 양은 일주일 간격으로 실시 하였다. 캘러스의 재분화능은 생장조절제가 첨가되지 않은 MS 기본 배지에 이식하여 확인하였다. 재분화된 식물은 밭흙과 모래를 1:1로 섞은 상토를 넣은 화분에 이식하여 20〜35℃로 유지되는 온실에서 자연조건의 일장으로 재배하였다.
대상 데이터
- 1995년 4월 5일부터 약 20여 회에 걸쳐 전국에서 수집한 Poa속 식물 중 108개의 왕포아풀 생태형과 국내에 도입되는 대표적인 품종 5가지를 포함한 총 113계통을 충남 부여군 세도면 소재 세원식물연구소의 시험포장에서 현지 외 보존하며 관리하였다. 각 계통들을 1x1 m의 시험구에 식재하고 시비는 일반적인 관리 수준 (3〜4회/년, 30〜40 g/n?/회, 18-18-18복비기준)으로 하였다.
- 성숙배를 이용한 캘러스 유도는 시험포에서 결실된 종자를 6월경 수확해 사용하였다. 70% ethyl alcohol에서 [ 분, 0.
- 수집된 자생 왕포아풀 생태형 중 잔디로서의 특성이 우수한 P38, P58, P77, P129계통과 도입 품종인 'Destiny', 'Glade', Nassau', 'Cheri', Midnight 등 5품종을 실험식물로 사용하였다. Nassau- Cheri', Midnight 의 완숙종자와, Destiny', P129의 미숙화서를 절편체로 사용하였고 'Glade', P77은 완숙종자와 미숙화서를 사용하여 절편체에 따른 배 발생 캘러스의 형성률을 조사하였다.
성능/효과
- 미숙화서를 절편 체로 사용했을 때는 11〜30%의 높은 효율로 배발생 캘러스가 유도되었으며, 수집종인 P77에서 배발생 캘러스 형성률이 가장 높았다. 다음으로 'Glade', Destiny, 순으로 높은 배 발생 캘러스 유도율을 보여 미숙화서가 왕포아풀의 배발생 배양에 효과적인 절편체임이 확인되었다(Figure 2). 미숙화서만을 절편 체로 이용하여 유전형별 배발생 캘러스 유도율을 조사한결과 전체적으로 68〜98%의 높은 효율을 보였으며, 유전형 간의 차이는 두드러지지 않았다 (Table 1).
- 온실에서 화분재배되어 유도된 미숙화서는 2월 24일에 치상하였을 때 배발생 캘러스의 형성률이 62%로 비교적 낮았다. 따라서 동절기 온실 재배한 식물보다는 포장에셔 채취한 미숙화서가 배발생 캘러스 유도에 더 효과적임을 확인할 수 있었다. 그러나 그 차이는 크지 않았고 온실에서는 동절기 중 쉽게 화서 발달을 촉진할 수 있는 장점이 있었다(Table 2).
- 1%의 낮은 유도율을 보였다. 미숙화서를 절편 체로 사용했을 때는 11〜30%의 높은 효율로 배발생 캘러스가 유도되었으며, 수집종인 P77에서 배발생 캘러스 형성률이 가장 높았다. 다음으로 'Glade', Destiny, 순으로 높은 배 발생 캘러스 유도율을 보여 미숙화서가 왕포아풀의 배발생 배양에 효과적인 절편체임이 확인되었다(Figure 2).
- 다음으로 'Glade', Destiny, 순으로 높은 배 발생 캘러스 유도율을 보여 미숙화서가 왕포아풀의 배발생 배양에 효과적인 절편체임이 확인되었다(Figure 2). 미숙화서만을 절편 체로 이용하여 유전형별 배발생 캘러스 유도율을 조사한결과 전체적으로 68〜98%의 높은 효율을 보였으며, 유전형 간의 차이는 두드러지지 않았다 (Table 1).
- 바발생 캘러스는 계대배양을 통해 6개월 이상 배발생능을 유지 히며 증식할 수 있었다. 캘러스 증식배지에서도 캘러스증스; 과 함께 자발적인 식물체 재분화가 일어나는 반면에 액체 진탕배양을 하면 재분화를 억제하며 배발생 캘러스를 급속히 증식시킬 수 있었다 (Figure ID, IE).
- 높았다. 시험포에서 재배되어 자연 유도된 미숙화서를 3용하여 4월 24일에 치상하였을 때 95%로 가장 높은 형성률을 보였다. 온실에서 화분재배되어 유도된 미숙화서는 2월 24일에 치상하였을 때 배발생 캘러스의 형성률이 62%로 비교적 낮았다.
- 유전형과 절편체에 따른 배발생 캘러스 형성 정도를 알아보기 위한 실험에서 완숙종자를 절편체로 사용했을 때 주로 배 부위에서 캘러스가 형성되었으며, 대부분 비배발생 캘러스의 발달이 많았다. 배 발생 캘러스는 Nassau'와 Midnight' 에서 0.
- 치상시기별 모본식물의 상태 및 배발생 캘러스의 유도율을 비교한 실험에서 배발생 캘러스의 형성률은 62〜95%로 전체적으로 높았다. 시험포에서 재배되어 자연 유도된 미숙화서를 3용하여 4월 24일에 치상하였을 때 95%로 가장 높은 형성률을 보였다.
후속연구
- 1995). 본 조직배양 방법은 도입종 및 국내 수집 생태형 등 여러 유전형의 왕포아풀의 배양에 효과적이기 때문에 기내돌연변이 등 왕포아풀의 기내육종이나 형질전환 연구에 적합하리라 판단되었다.
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