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문제 정의
- 본 연구는 OECD의 대표적 시험어종의 하나이며 생식 및 발생독성에 널리 사용되고 있는 송사리 (Oryzias latipes) 의 수컷에 17β-estradiol을 노출시켜 송사리 수컷의 성적 행위에 미치는 영향을 관찰함으로써 행위독성 연구를 통한 내분비계 장애물질의 검색법을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- , USA)을 아세톤에 200(ig/mZ의 농도로 녹여 시험원액을 만들어 사용하였다. 시험물질의 노출농도는 최종 농도가 2 ㎍/l 및 20 ㎍/l가 되도록 시험원액을 희석수로 희석하여 노출시켰으며, 대조군의 경우 아세톤만을 0.1 ml/l 농도로 첨가하였다. 희석수는 본 연구실의 사육수로 사용하고 있는 pH 7.
- 시험물질 처리를 위해 우선 송사리 수컷 15마리를 분리 하여 4 l 원형수조에서 사육조건과 동일한 조건으로 1주일 간 순화시킨 후, 2 l의 시험용액이 담긴 대조군 및 처리군 수조에 각각 수컷 5마리를 넣고 14일간 노출시켰다. 먹이는 1일 1회 알테미아를 일정량 공급하였다.
- 시험물질 처리를 위해 우선 송사리 수컷 15마리를 분리 하여 4 l 원형수조에서 사육조건과 동일한 조건으로 1주일 간 순화시킨 후, 2 l의 시험용액이 담긴 대조군 및 처리군 수조에 각각 수컷 5마리를 넣고 14일간 노출시켰다. 먹이는 1일 1회 알테미아를 일정량 공급하였다. 반지수식방법을 적용하여 2일에 1회 시험액을 교환하였으며, 시험액을 교 환할 경우 먹이는 시험용액 교환 4시간 전에 공급하였다.
- 먹이는 1일 1회 알테미아를 일정량 공급하였다. 반지수식방법을 적용하여 2일에 1회 시험액을 교환하였으며, 시험액을 교 환할 경우 먹이는 시험용액 교환 4시간 전에 공급하였다.
- 시험물질에 노출시킨 수컷 송사리와 정상 암컷 사이의 성적 행위 관찰에 앞서 시험물질 노출이 종료되기 1주일 전에 건강한 암컷 30마리를 선별하여 10 l 원형수조에서 사육조건과 동일한 조건으로 순화시켰다. 순화된 암컷 중 9마리를 임의로 선별하여 마취하지 않은 상태로 등쪽 근육에 prostaglandin F2a(PGF) 유사체인 luprostiol(Intervet International B.
- 시험물질에 노출시킨 수컷 송사리와 정상 암컷 사이의 성적 행위 관찰에 앞서 시험물질 노출이 종료되기 1주일 전에 건강한 암컷 30마리를 선별하여 10 l 원형수조에서 사육조건과 동일한 조건으로 순화시켰다. 순화된 암컷 중 9마리를 임의로 선별하여 마취하지 않은 상태로 등쪽 근육에 prostaglandin F2a(PGF) 유사체인 luprostiol(Intervet International B.V., Holland) 10 μ/(75 ㎍ luprostiol)를 일회용 주사기 (1 cc, 29 Gxl/2"X 사용하여 각각 주사한 후 사각수조[14(L)×l2(W)×ll(H)cm]에 세 마리씩 넣고, 30분후 14일간 시험물질을 노출시킨 처리군 또는 대조군에서 임의로 선택한 수컷 두 마리를 세 마리의 암컷이 있는 각각의 사각수조에 넣은 후 비디오카메라를 이용하여 1시간 동안 녹화하고 수컷의 성적 행위을 분석하였다.
- 17β-Estradiol이 수컷의 생식능력에 미치는 영향을 알아보기 위해 170-estradiol을 노출시킨 수컷과 정상 암컷을 함께 일주일 동안 사육시켰다. 대조군 및 각 처리군의 5마리 수컷을 3 l의 사육수가 담긴 원형수조로 옮기고, 일주일 동안 사육수에서 분리 순화시킨 암컷을 수컷이 있는 각 수조에 7마리씩 넣은 후 일주일 동안 생산되는 총 산란수 및 수정율을 조사하였다.
- 17β-Estradiol이 수컷의 생식능력에 미치는 영향을 알아보기 위해 170-estradiol을 노출시킨 수컷과 정상 암컷을 함께 일주일 동안 사육시켰다. 대조군 및 각 처리군의 5마리 수컷을 3 l의 사육수가 담긴 원형수조로 옮기고, 일주일 동안 사육수에서 분리 순화시킨 암컷을 수컷이 있는 각 수조에 7마리씩 넣은 후 일주일 동안 생산되는 총 산란수 및 수정율을 조사하였다. 관찰기간중 물의 오염을 방지하기 위해서 2일에 1회 사육수를 교환하였으며, 투명하지 않고 혼탁해진 미수정란은 제거하였다.
- 대조군 및 각 처리군의 5마리 수컷을 3 l의 사육수가 담긴 원형수조로 옮기고, 일주일 동안 사육수에서 분리 순화시킨 암컷을 수컷이 있는 각 수조에 7마리씩 넣은 후 일주일 동안 생산되는 총 산란수 및 수정율을 조사하였다. 관찰기간중 물의 오염을 방지하기 위해서 2일에 1회 사육수를 교환하였으며, 투명하지 않고 혼탁해진 미수정란은 제거하였다. 이때 산란을 위해 광주기는 16시간 8시간(명.
대상 데이터
- 국립 환경 연구원 어류사육실에서 수온 25±1℃, pH 7.5± 0.2, 용존산소 7~8mg/l 및 광주기 16시간/8시간(명/암)의 실험실 조건으로 계대 사육한 송사리(Oryzias latipes)를 시험어로 사용하였다. 먹이는 알테미아를 1일 1회 충분히 공급하였으며 본 시험에 사용된 개체는 부화 후 5개월 이상된 성숙한 개체로서 산란율이 높은 사육수조에서 외형상 기형이 없고 건강한 것만을 사용하였다.
- 2, 용존산소 7~8mg/l 및 광주기 16시간/8시간(명/암)의 실험실 조건으로 계대 사육한 송사리(Oryzias latipes)를 시험어로 사용하였다. 먹이는 알테미아를 1일 1회 충분히 공급하였으며 본 시험에 사용된 개체는 부화 후 5개월 이상된 성숙한 개체로서 산란율이 높은 사육수조에서 외형상 기형이 없고 건강한 것만을 사용하였다.
- 시험물질은 대표적인 에스트루겐인 17|3-estradiol(Sigma Chemical Co., USA)을 아세톤에 200(ig/mZ의 농도로 녹여 시험원액을 만들어 사용하였다. 시험물질의 노출농도는 최종 농도가 2 ㎍/l 및 20 ㎍/l가 되도록 시험원액을 희석수로 희석하여 노출시켰으며, 대조군의 경우 아세톤만을 0.
- 1 ml/l 농도로 첨가하였다. 희석수는 본 연구실의 사육수로 사용하고 있는 pH 7.5의 탈염소한 수돗물을 사용하였다.
성능/효과
- 시험물질인 17β-estradiol의 노출기간 중 사망한 수컷 송 사리는 없었으며, 기타 유의한 이상 증상도 관찰되지 않았다. 성적 행위 관찰을 위해 정상 암컷에 PGF의 유사체인 luprostiol을 투여하였는데, PGF는 배란이 일어난 어류 암컷의 난소 또는 수란관에서 분비되는 것으로 여겨지며 순 환계를 통해 이동하여 뇌에 작용하여 산란행위를 유도하고 동시에 수컷의 성적 행위를 자극하는 것으로 알려져 있다(Kobayashi 등, 1993; Zheng 등, 1997).
- ,elinus alpinus 수컷에서 분비되는 PGF는 pheromone처럼 암컷의 성적 행위를 유도하는 것으로 보고 된 바 있다(Sveinsson 등, 2000). 본 연구에서 수컷에 대한 14일 동안의 17|i-estradiol 노출 종료 후에 PGF를 주사한 정상적 인 암컷과 2 ㎍/l 및 20㎍/l 농도의 17&-estradiol을 노출시킨 수컷 사이에서는 Table 1에서 보는 바와 같이 교 차(crossing)행위 뿐만 아니라 수컷의 어떠한 구애행위도 관찰되지 않았다. 그러나, 시험물질을 노출시키지 않은 수 컷 대조군의 경우 Fig.
- 본 연구에서 수컷에 대한 14일 동안의 17|i-estradiol 노출 종료 후에 PGF를 주사한 정상적 인 암컷과 2 ㎍/l 및 20㎍/l 농도의 17&-estradiol을 노출시킨 수컷 사이에서는 Table 1에서 보는 바와 같이 교 차(crossing)행위 뿐만 아니라 수컷의 어떠한 구애행위도 관찰되지 않았다. 그러나, 시험물질을 노출시키지 않은 수 컷 대조군의 경우 Fig. 1에서 보는 바와 같이 전형적인 수 컷의 구애행위인 암컷을 따라다니는 추적 (follwing), 암컷 밑에서 한바퀴 원을 그리며 유영하는 구애춤(courtship dance) 및 교차(crossing) 등의 행위가 나타났으며, 비디오 카메라를 이용하여 1시간 동안 관찰한 결과 총 21회의 구 애춤과 5회의 교차(crossing)가 관찰되었다. 추적행위는 빈 도에 있어서 대조군과 명확한 차이가 나타나지만 17β- estradiol 처리군에서도 수회 나타났다.
- 반면 금붕어 수컷의 성적 행위는 수컷 성호르몬의 일종인 11-ketotestosterone에 의해 유도되는 것으로 보고되었다(Stacey 등, 1996). 따라서 본 연구에서 17p-estradiol 노출에 의한 수컷의 성적 행위 억제는 17β- estradiol에 의한 체내 호르몬 수준의 불균형에 의한 것으로 사료된다.
- 한편, 2 ㎍/l 및 20㎍/l의 농도로 17|3-estradiol을 14일간 각각 노출시킨 수컷 5마리와 정상적인 암컷 7마리를 한 수조에 넣고 1주일 동안의 총산란수 및 수정율을 관찰한 결과 Fig. 2 및 Fig. 3에서 보는 바와 같이 2 ㎍/l의 17-estradiol 처리군의 경우 대조군에 비해 다소 높은 산 란율을 보였고, 수정율은 대조군에 비해 약간 감소한 결과를 나타내었다. 반면에 20 |ig// 처리군의 경우 산란수가 현 저히 저하되었을 뿐만 아니라 산란된 알도 전혀 수정이 되 지 않았다.
- 반면에 20 |ig// 처리군의 경우 산란수가 현 저히 저하되었을 뿐만 아니라 산란된 알도 전혀 수정이 되 지 않았다. 따라서 17&-estradiol의 농도 증가에 따라 수컷의 생식기능이 억제되었음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 성숙한 송사리 수컷에 17β-estmdiol을 14일간 1-100 nmoW (약 0.
후속연구
- 송사리 수컷 정소에 난소조직이 형성되는 testis-ova의 발생은 발생단계 초기에서부터 에스트로젠 성 화학물질에 장기간 노출될 때 나타나며 성숙한 수컷 개체에 17P- estradi이을 36일간 본 연구에 사용된 농도보다도 높은 100 ㎍/l의 농도로 노출시켰을 때에도 발생되지 않음이 보고되었다(Gray 등, 1997; Gray 등, 1999). 따라서 성적 행위관찰은 에스트로젠성 물질의 저농도 노출에 의한 아급 성적 영향을 평가하는데 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 판단되며 향후 이러한 결과를 바탕으로 내분비계장애 물질로 추정되는 산업용화학물질 등에 의한 성적 행위 변화를 조사함으로써 내분비 계 장애물질 검 색시험으로서 행 위변화를 주요한 종말점으로 활용할 수 있을 것으로 기대 된다.
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