Objectives: This study was carried out to evaluate the effects of embryonic stage, cryoprotectant, and freezing-thawing method on the rates of survival and development of the cryopreserved mouse early embryo and finally to establish the cryopreservation method of surplus embryos obtained during assi...
Objectives: This study was carried out to evaluate the effects of embryonic stage, cryoprotectant, and freezing-thawing method on the rates of survival and development of the cryopreserved mouse early embryo and finally to establish the cryopreservation method of surplus embryos obtained during assisted reproductive technology (ART). Materials and Methods: Two to eight cell embryos were obtained from oviducts of mated $F_1$ hybrid female mice superovulated by pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG) and human chorionic gonadotropin (hCG). Two-step 1,2-propanediol (PROH), dimethylsulfoxide (DMSO) and 4-step PROH DMSO were used as cryoprotectant and dehydration and rehydration method of embryos, and slow-cooling or rapid-cooling method was used as frozen program. The survival rates of embryos were measured after thawing and rehydration, and the developmental rates of embryos were compared and observed during culturing embryos for 24, 48, 72, 96 hrs. Results: As for the survival and development rates of embryos according to embryonic stage, the survival rate of 2 cell stage in PROH and DMSO was significantly higher than 4-8 cell (64.5% versus 62.1 %,79.7% versus 73.2%) (p<0.01, p<0.01), but the development rates of 4-8 cell embryos in PROH and DMSO were significantly higher than 2 cell embryos for whole culture period (p<0.01) and the development rates of 4-8 cell embryos in PROH were significantly higher than 2 cell embryos in DMSO (p<0.01). As for the survival and development rates of embryos according to cryoprotectant, the survival rate of 2 cell embryo in DMSO was significantly higher than that in PROH (74.4% versus 64.5%) (p<0.01), whereas the development rate of embryos was not differ till 24 hrs. The developmen1 rate from morular to hatching blastocyst, however, was significantly higher in PROH than in DMSO during 48 hr (p<0.01). The survival rate of 4-8 cell embryo was 62.1% in PROH and 73.2% in DMSO. The development rates of embryo in PROH were significantly higher for whole culture periods (p<0.01, 0.05). In respect to the effect of freezing and thawing program on the survival and development rates of embryos, method of slow cooling and rapid thawing was more effective than that of rapid cooling and rapid thawing. Conclusions: The survival rate of embryo in 2 cell stage was higher than in 4-8 cell stage, and PROH appears more effective cryoprotectant than DMSO because PROH showed better development rates of embryos in 2 and 4-8 cell stage. Moreover, slow cooling and rapid thawing method was considered as the best cryopreservation program.
Objectives: This study was carried out to evaluate the effects of embryonic stage, cryoprotectant, and freezing-thawing method on the rates of survival and development of the cryopreserved mouse early embryo and finally to establish the cryopreservation method of surplus embryos obtained during assisted reproductive technology (ART). Materials and Methods: Two to eight cell embryos were obtained from oviducts of mated $F_1$ hybrid female mice superovulated by pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG) and human chorionic gonadotropin (hCG). Two-step 1,2-propanediol (PROH), dimethylsulfoxide (DMSO) and 4-step PROH DMSO were used as cryoprotectant and dehydration and rehydration method of embryos, and slow-cooling or rapid-cooling method was used as frozen program. The survival rates of embryos were measured after thawing and rehydration, and the developmental rates of embryos were compared and observed during culturing embryos for 24, 48, 72, 96 hrs. Results: As for the survival and development rates of embryos according to embryonic stage, the survival rate of 2 cell stage in PROH and DMSO was significantly higher than 4-8 cell (64.5% versus 62.1 %,79.7% versus 73.2%) (p<0.01, p<0.01), but the development rates of 4-8 cell embryos in PROH and DMSO were significantly higher than 2 cell embryos for whole culture period (p<0.01) and the development rates of 4-8 cell embryos in PROH were significantly higher than 2 cell embryos in DMSO (p<0.01). As for the survival and development rates of embryos according to cryoprotectant, the survival rate of 2 cell embryo in DMSO was significantly higher than that in PROH (74.4% versus 64.5%) (p<0.01), whereas the development rate of embryos was not differ till 24 hrs. The developmen1 rate from morular to hatching blastocyst, however, was significantly higher in PROH than in DMSO during 48 hr (p<0.01). The survival rate of 4-8 cell embryo was 62.1% in PROH and 73.2% in DMSO. The development rates of embryo in PROH were significantly higher for whole culture periods (p<0.01, 0.05). In respect to the effect of freezing and thawing program on the survival and development rates of embryos, method of slow cooling and rapid thawing was more effective than that of rapid cooling and rapid thawing. Conclusions: The survival rate of embryo in 2 cell stage was higher than in 4-8 cell stage, and PROH appears more effective cryoprotectant than DMSO because PROH showed better development rates of embryos in 2 and 4-8 cell stage. Moreover, slow cooling and rapid thawing method was considered as the best cryopreservation program.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서, 본 연구는 생쥐 초기 배아를 이용하여 동결 보존된 배아의 생존율과 발달률에 영향을 미치는 요인들의 상관관계를 알아보고 동결보존법을 체계화하고자 배아의 발달단계, 동결 및 해빙속도, 동해방지제의 종류에 따라 동결보존한 후 해동하고 배아의 생존율 및 발달률을 조사하여 동결보존법에 대한 최적조건들을 살펴봄으로써 임상적 적용에 대한 유용성을 검토하고자 시도하였다.
제안 방법
(hCG, Sigma)을 복강 주사하였다. hCG 주사 후 즉시 암컷과 수컷을 1:1로 합사하여 교배를 유도하였다. 2세포기 배아는 hCG 주사 48시간 후에, 4-8세포기 배아는 hCG 주사 60~62시간 후에 암컷의 수란관에서 회수하였다.
과배 란 유도를 위하여 5 IU 의 pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG, Sigma)을 생쥐 암컷에 복강 주사하고 48 시간 후 5 IU 의 human chorionic gonadotropin (hCG, Sigma)을 복강 주사하였다. hCG 주사 후 즉시 암컷과 수컷을 1:1로 합사하여 교배를 유도하였다.
배아를 동결하지 않고 배양한 군을 대조군으로 하고 배아의 동결 후 생존율 및 배 발달률을 조사한 군을 실험군으로 설정하였다. 실험군은 배아의 발달단계, 동해방지제, 배아의 동결속도에 따라 각각 2 세포와 4-8세포 배아, PROH와 DMSO, 그리고 완만 동결-급속해동과 급속동결-급속해동군으로 분류하였다.
배아의 세포질 내 존재하는 물을 제거하고 제거된 양만큼 동해방지제를 세포질 내로 유입시키는 탈수과정은 2단계 방법을 사용하였다. 정상적으로 발달한 배아를 1 단계 1.
실험군으로 설정하였다. 실험군은 배아의 발달단계, 동해방지제, 배아의 동결속도에 따라 각각 2 세포와 4-8세포 배아, PROH와 DMSO, 그리고 완만 동결-급속해동과 급속동결-급속해동군으로 분류하였다.
재수화 과정이 완료된배아는기본용액에서 3회 세척한 후 상온에서 5분이 경과하였을 때 형태적인생존성을 확인하였다.
2단계 방법을 사용하였다. 정상적으로 발달한 배아를 1 단계 1.5 M PROH 또는 1.5 M DMSO, 2 단계 1.5 M PROH에 0.1 M sucrose가 첨가된 용액 또는 1.5 M DMSO에 0.1 M sucrose가 첨가된 용액에서 각각 15분간 노출시켜 탈수를 유도하였다.
1 M sucrose를 혼합하여 제조하였다. 제조한 동해방지제와 해동액은 각각 0.22 μ millipore filter (Acrodisc 4192, German)로 여과하여 멸균을 실시하였다.
마지막으로 배아는 20% 소태아혈청이 포함된 인산 완충액에서 5분간 처리하고 배양액에 옮겨 배양하였다. 한편의 해동된 배아는 1.0 M DMSO에 0.2 M sucrose 가 첨가된 용액과 0.5 M DMSO에 0.2 M sucrose가 포함된 기본용액에서 각각 5분씩 처리한 후 기본용액에 0.2 M sucrose만 포함된 해빙액에서 다시 5분간 처리하고 마지막으로 20% 소태아혈청이 포함된 인산 완충액에서 5분간 처리하여 재수화 과정을 마쳤다
해동된 배아를 상온에서 기본배양액에 20분간 노출시킨 후 배양액으로 옮겨 세포 발달단계에 따라이산화탄소 부란기에서 2세포기는 96시간, 4-8세포기는 72시간 배양 후 hatching까지 진행된 비율을 구하였다.
1 M sucrose를 첨가한 용액을 사용하였다. 해동액은 기본용액에 DMSO를 첨가하여 각각 0.5 M, 1.0 M 의 용액에 0.1 M sucrose를 혼합하여 제조하였다. 제조한 동해방지제와 해동액은 각각 0.
5 M PROH에 QI M sucrose를 첨가한 용액을 사용하였다. 해동액은 기본용액에 PROH를 첨가하여 각각 0.5 M, 1.0 M 용액을 만든 후 0.1 M sucrose를 혼합하여 제조하였다. 제조한 동해방지제와 해동액은 각각 0.
회수한 배아는 재수화 용액에서 3단계로 옮겨가면서 탈수의 역과정을 수행하였다 해동 회수된 배아는 1.0 M PROH에 0.2 M sucmse가 첨가된 용액과 0.5 M PROH에 0.2 M sucrose가 첨가된 용액을 포함한 기본용액에서 각각 5분간 처리한 후 0.2 M sucrose만 포함된 해동액에서 5분간 처리하였다. 마지막으로 배아는 20% 소태아혈청이 포함된 인산 완충액에서 5분간 처리하고 배양액에 옮겨 배양하였다.
대상 데이터
동해방지제는 기본용액에 dimethyl sulfoxide (DMSO, Merk)를 첨가한 1.5 M DMSO와 1.5 M DMSO에 0.1 M sucrose를 첨가한 용액을 사용하였다. 해동액은 기본용액에 DMSO를 첨가하여 각각 0.
본 실험에서는 생쥐 제 1 세대 잡종 (C57BL#X CBA8)으로 생후 4~5주된 암컷과 6~8주된 생식 력이 확인된 수컷을 사용하였다 이들은 명기와 암기가 조절되는 (12시간:12시간) 사육실에서 사육하였다.
데이터처리
실험을 통하여 얻은 모든 결과들은 %2-test와 Student t-test를 시 행하여 통계 적 유의성을 조사하였고 p값이 0.05 미만일 때를 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
4℃/min 로 보고되고 있으며, 7 -80℃까지 냉각하는 방법7,29과 -30℃까지만 냉각한 후 액체질소 속에 담그는 완만 동결법이 알려져 있다.* 완만동결법은 보다 많은 세포를 탈수시킬 수 있고 해동 후에도 세포의 생존성을 증가시킨다고 하는데 본 연구 결과에서도 완만 동결-급속해동방법에서 좋은 결과를 얻었다. 그렇지만 모든 세포에 있어 완만동결이 좋은건 아니며 각각의 세포에 적합한 최적의 동결속도가 있다고 한다.
2) 4-8세포기 배아 (Table 4)4-8세포기 배아를 PROH와 DMSO를 사용하여 동결 후 해동해 본 결과 생존율에 있어서는 PROH에서 62.1%, DMSO에서 73.2%로 DMSO에서 유의하게 높았으며 (p<0.01), 해동 후 24, 48, 72시간 배양에 따른 배 발달률에 있어서는 PROH에서 84.1%, 86.6%, 76.2%이었고, DMSO에서는 67.0%, 49.5%, 349%로 PROH에서의 배 발달률이 지속적으로 유의하게 높았다 (p<0.01, p<0.05).
2세포기 배아를 PROH와 DMSO를 사용하여 동결 후 해동해 본 결과 생존율에 있어서는 PROH에서 64.5%, DMSO에서 74.4%로 DMSO에서 유의하게 높았으며 (p<0.01), 해동 후 24, 48, 72, 96시간 배양에 따른 배 발달률에 있어서는 PROH에서 82.8%, 58.9%, 58.3%, 53.0%이 었고, DMSO에서는 80.8%, 35.1%,35.1%, 31.8%로 PROH에서의 배 발달률이 48시간 이후부터 유의하게 높았다 (p<0.01).
25,26 본 연구에서도 2, 4-8세포기 배아 동결 -해동시 PROH와 DMSO에 sucrose# 혼합하여 사용해 해동 후 세포손상을 감소시키려 노력하였으나 배 발달률에 있어서 대조군만큼의 성적을 얻지는 못하였다. 2세포기에서는 PROH 사용시 해빙 후 배양 48시간째 배 발달률이 유의하게 감소하여 (p<0.01), 동해로의 배 발달률 감소를 나타냈으나 그 이후 배양 기간 동안에는 유사한 배 발달률을 나타내어 동해방지제의 독성에서 벗어나 동해에 대한 영향을 받지 않음을 알 수 있었다. 그리고 DMSO에서도 해동 후 배 발달률에 있어서 유사한 효과를 얻었다.
그리고 DMSO에서도 해동 후 배 발달률에 있어서 유사한 효과를 얻었다. 4-8 세포기 배아에서는 동해방지제로 PROH 사용시 해동 후 배 발달률에는 변화가 없어서 동해로 인한 상해를 입지 않음을 알 수 있었으나, DMSO에서는 배양 48시간째 배 발달이 유의하게 감소하여 동해에 대한 상해를 입음을 알 수 있었다. 그렇지만 본 실험에 사용한 PROH는 2, 4-8세포기 배아의 동결 후 DMSO 사용시 보다 배 발달률에 있어서 더 유의하게 증가된 성적을 나타내어 생쥐 2세포를 이용하여 DMSO에서 보다 PROH 사용시 배포까지의 발달에 좋은 성적을 얻었던 Macas 등27과 생쥐 전핵 배아를 이용하여 PROH에서 더 효율적인 결과를 얻었던 Van-den-Abbeel 등*의 보고와 일치하였다.
본 연구에서 생쥐 초기 배아를 이용하여 동결 보존된 배아의 생존율 또는 발달률에 영향을 미치는 요인들의 상관관계를 알아본 결과 배아의 발달단계에 따른 동결-해동 후 생존율에 있어서는 2세포기 배아가 4-8세포기 배아보다 유의하게 높았으나 (p< 0.01) 배 발달률에 있어서는 4-8세포기 세)아가 유의하게 (p<0.01) 높아 생존율과 배 발달률과는 상관관계가 없는 것으로 사료된다. 또한, 동해방지제에 따른 배아의 생존율에 있어서는 2, @8세포기 배아 모두 DMSO에서 유의하게 높았으나 (jxO.
생쥐 2세포기와 4-8세포기 배아를 PROH와 DMSO 동해방지제를 사용하여 동결보존 후 생존율을 조사해 본 결과 2세포기 배아의 생존율이 PROH에서 64.5% DMSO에서 79.7%, 4-8세포 배아의 생존율이 각각 62.1%, 73.2%로 PROH와 DMSO 두 동해방지제에서 모두 2세포기 배아의 생존율이 유의하게 높았으며 (pO.Ol), 해빙 후 2세포기와 4-8세포기를 24, 48, 72, 96시간 배양해 본 결과 배 발달률에 있어서는 PROH를 사용한 2세포기 배아에서 82.8%, 58.9%, 58.3%, 53%, 4-8세포기에서는 84.1%, 86.6%, 72.2%이였고 DMSO를 사용한 2세포기 배아에서는 80.7%, 29.8%, 30.7%, 20.2%, 4-8세포기에서는 49%, 36.2%, 25.5%로 해빙 후 배 발달률에 있어서는 PROH와 DMSO에서 모두 4-8세포기 배아가 2세포기 배아보다 유의하게 높은 배 발달률을 나타내었다 (p<0.01).
생쥐배아의 발달단계에 따른 동결보존 효과에서 더 높은 생존율을 나타내었던 2세포기 배아를 동결 방법을 달리하여 생존율 및 발달률을 비교 조사해본 결과 완만동결-급속해동방법에 따른 배아의 생존율이 74.8%, 급속동결-급속해동방법은 3.2%로 완만 동결-급속해동방법에서 유의하게 더 높은 생존율을 보였으며 (pxO.OOl), 또한 배 발달률에 있어서도완만동결-급속 해동 방법은 39J%가 부화 배포까지 발달한 반면 급속동결-급속해동방법은 해동 후 4세포기까지만 11.1%의 배 발달이 진행되고 그 이후로는 발달이 정지되었다.
후속연구
또한 해동시 동해방지제의 제거가 부적절하게 이뤄질 때도 동해방지제의 독성으로 인해 세포는 손상을 입을 수 있다. 그래서 세포의 동결과정 동안에 만들어질 수 있는 결빙현상과 해동시 동해방지제로 인한 독성 효과를 최소화하기 위해 보다 더 완벽 한 동결보존법의 개발이 필요하다.
31 이는 삼투압 차에 따른 반응속도와 물의 이동에 대한 온도의 효과가 세포마다 다르기 때문으로 생각되고 있다. 그러나 완만동결방식은 동결 후 생존율이 좋은 반면 경비와 시간이 많이 소요되는 단점이 있어 최근에 들어서는 초자화동결법이 개발되면서 고농도의 동해방지제에 바로 노출시켜도 생존율이 상당히 좋다고 보고되고 있어32 이에 대한 연구가 앞으로 기대된다.
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