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문제 정의
- 이러한 기술은 대부분의 과정을 로봇으로 조절하게 하여 기존의 방법에 비해 수백 배에서 수천 배 빠른 속도로 수행할 수 있게 되고 있다. 따라서 본 고에서는 분지아미노산 생합성 과정(그림 1)에 관여하는 첫 번째 효소인 acetolactate synthase (ALS)를 대상으로 수행할 수 있도록 개발한 고효율 검색 방법과 이를 이용하여 선발한 새로운 ALS 저해 화합물을 소개하고자 한다.
제안 방법
- 효소반응을 수행할 경우 많은 시험관을 사용하게 되면 처음과 마지막 시료 사이에서의 시간차이로 인하여 결과가 정확하지 못하게 된다. 따라서 속도를 비교하기 위한 기준을 설정하기는 어렵지만 일반적으로 pipette을 사용하여 12회 분주 하는데 1분 정도 소요되고, 96-well의 구멍이 12 X 8개로 만들어져 있기 때문에 이를 기준으로 하였다. 본 실험방법을 기존의 방법과 비교할 경우 한사람이 1회 수행한다고 하면(그림 1) 효소 활성을 측정하는 것까지 8배 효율을 증대시킬 수 있다.
- 볍씨 종자를 파종하고 온실에서 생육시키면서 2.5 엽기에도 달하였을 때 잎을 수확하고 이를 액체질소와 함께 마쇄하였다. 효소 추출은 Ray의 방법(Ray, 1982)을 수정하여 생체시료 50 g 당 5 mM MgCb 과 10 mM sodium pyruvate을 용해시킨 0.
- 본 논문에 소개한 ALS 활성 검정방법은 기존의 방법을 대량 고속 검정용으로 개량하였다. ALS를 저해하는 새로운 제초제를 개발하기 위해서는 1차 적으로 in vitro 시험을 통하여 ALS 활성을 저해하는 선도화합물을 발굴하고 이를 활용하여 유도체를 합성하게 된다.
- 발색 후 96-well filter/centrifuge를 동시에 수행한다. 이를 microplate reader를 사용하여 530 rm에서 흡광도를 즉정 하고 결과를 computer program excel을 사용하여 계산한다.
- 효소의 반응은 반응액을 첨가하면서 개시하였고, 6 N H2SO4 10㎕를 첨가하여 반응을 종료시켰다 효소 활성은 Westerfield의 방법(Westerfield, 1945) 에따라 생성된 acetoin양을 다음과 같이 측정하였다. 즉, 반응을 송료시킨 시료는 60C 의 항온수조에서 30분간 decar boxylation 시키고 0.5%(w/v)의 creatine용액 0.5ml와 10% NaOH에 용해시킨 5%(w/v)의 1-naphtol 용액 100 ㎕를 넣고 vortex mixer5- 10초간 섞어 준 다음 60°C의 항온수조에서 30분 동안 발색시켰다, 발색 후 96-well filter/ centrifuge에서 여과 및 원심분리를 동시에 수행하였다 이를 microplate leader를 사용하여 530 nm에서 흡광도를 측정하고 결과를 computer program excel을 사용하여 계산하였다. 효소의 활성은 같은 방법으로 작성한 standard curve를 이용하여 단백질 mg당 단위 시간에 생성되는 acetoin 의 양으로 표시하였다.
- 상징액을 ammonium sulfate(35%)로 분별 침전 시켜 2Q000xg, 4Q에서 20분간 원심 분리한 후 상징액은 버리고 침전물을 취하였다. 침전물을 50 mM potassium phospliate(pH 7.0) 완충용액에 현탁시켜 동일한 완충용액으로 포화시킨 Sephadex G-25컬럼을 통과시켰다 컬럼으로부터 활성부위만을 채취하여 단백질 함량을 측정 (Bradford, 1976)하고 조효소액의 단백질 함량이 10 mg/mU가 되도록 희석하여 효소활성 측정에 사용하였다. 잔여 조효소액은 액체질소에 보관하면서 사용하였다.
- 5 엽기에도 달하였을 때 잎을 수확하고 이를 액체질소와 함께 마쇄하였다. 효소 추출은 Ray의 방법(Ray, 1982)을 수정하여 생체시료 50 g 당 5 mM MgCb 과 10 mM sodium pyruvate을 용해시킨 0.1 M potassium phosphate 완충용액 (pH 7.5) 100 ml를 넣어 균질화 시킨 후 1겹의 Mira- cloth로 거른 여과액을 원심분리(20, 000 x& 4°C, 20min) 하였다. 상징액을 ammonium sulfate(35%)로 분별 침전 시켜 2Q000xg, 4Q에서 20분간 원심 분리한 후 상징액은 버리고 침전물을 취하였다.
- 5ml와 10% NaOH에 용해시킨 5%(w/v)의 1-naphtol 용액 100 ㎕를 넣고 vortex mixer5- 10초간 섞어 준 다음 60°C의 항온수조에서 30분 동안 발색시켰다, 발색 후 96-well filter/ centrifuge에서 여과 및 원심분리를 동시에 수행하였다 이를 microplate leader를 사용하여 530 nm에서 흡광도를 측정하고 결과를 computer program excel을 사용하여 계산하였다. 효소의 활성은 같은 방법으로 작성한 standard curve를 이용하여 단백질 mg당 단위 시간에 생성되는 acetoin 의 양으로 표시하였다. 단백질의 양은 Bradford법으로 측정하였다(Bradford, 1976).
대상 데이터
- 시험에 사용한 화합물은 기존문헌 조사를 통하여 제초 활성이 기대되는 화합물107개를 선발하였다(Dagley and Nicholson, 1970; Kearney and Kaufman, 1988; Hatzios and Hoagland, 1989; Cobb, 1992; Weller et al.f 1993; Devine et al., 1993; Dawson et (d., 1986; Zolliner, 1993; ; Anderson, 1996; Dey and Harbome, 1997). 조사된 화합물은 Sigma 및 Aldrich 사lemical(USA)사로부터 구매하였으며 알파벳 순서로 정리하여 HIT-일련번호로 코드화 하였다(표 1).
- , 1986; Zolliner, 1993; ; Anderson, 1996; Dey and Harbome, 1997). 조사된 화합물은 Sigma 및 Aldrich 사lemical(USA)사로부터 구매하였으며 알파벳 순서로 정리하여 HIT-일련번호로 코드화 하였다(표 1).
- 지금까지 알려진 ALS 저해 제초제로는 sulfonylurea계, imidazolinone 계, triazolopyrimidine sulfonanilide 계, pyr- imidyloxybenzoic acid계 등이 보고(Rendina and Abell, 1994)되어 있지만 새로운 구조의 ALS 저해 화학물질을 탐색하기 위하여 107개의 식물 특이적 효소 저해제를 대상으로 조사하였다. 처리 화학물질 중에서 최종농도 100 UM로처리할 경우 11개의 화학물질이 100% 저해하였고(그림 4), 기타 6개의 화학물질은 저해활성을 보였지만 강력하지는 않았다.
이론/모형
- 효소의 활성은 같은 방법으로 작성한 standard curve를 이용하여 단백질 mg당 단위 시간에 생성되는 acetoin 의 양으로 표시하였다. 단백질의 양은 Bradford법으로 측정하였다(Bradford, 1976).
- 8 ㎕를 96・well에 담고 35°C7 수조에서 30분간 반응시켰다. 효소의 반응은 반응액을 첨가하면서 개시하였고, 6 N H2SO4 10㎕를 첨가하여 반응을 종료시켰다 효소 활성은 Westerfield의 방법(Westerfield, 1945) 에따라 생성된 acetoin양을 다음과 같이 측정하였다. 즉, 반응을 송료시킨 시료는 60C 의 항온수조에서 30분간 decar boxylation 시키고 0.
성능/효과
- 따라서 속도를 비교하기 위한 기준을 설정하기는 어렵지만 일반적으로 pipette을 사용하여 12회 분주 하는데 1분 정도 소요되고, 96-well의 구멍이 12 X 8개로 만들어져 있기 때문에 이를 기준으로 하였다. 본 실험방법을 기존의 방법과 비교할 경우 한사람이 1회 수행한다고 하면(그림 1) 효소 활성을 측정하는 것까지 8배 효율을 증대시킬 수 있다.
- 이를 위해서는 효소 표준품을 사용하는 것이 가장 바람직하지만 상품화된 효소가 없기 때문에 충분한 양의 효소를 추출하여 보관하면서 사용하여야 할 것이다(Biiger and Sandmann, 1992; Streibig and Kudsk, 1993). 이를 위해서 추출한 효소액을 1 ml 내외의 작은 병에 나누어 액체질소에 보관하면서 효소활성을 측정한 결과 보관된 효소는 4개월까지 실험에 유효한 활성을 보여 주었다(자료생략). 효소활성 측정방법은 기존에 알:려진 시험방법을 기본으로 하여 용기와 조합비율을 조정한다.
후속연구
- z 1988). 앞으로 이들에 대한 작용기구는 물론 식물 체내에서의 행동, 제초효과 및 선택성 등에 대한 연구가 수행되어져야 할 것이며, 이러한 결과를 토대로 신규 후보 화합물의 합성이 성공적으로 수행될 수 있을 것이다.
- 100% 저해하는 화학물질을 대상으로 처리농도를 감소시켰을 때 저해 활성도 크게 감소되었지만 기존의 저해제 구조와 전혀 다른 화학물질들이 ALS 활성을 저해시킨다는 것은 새로운 유도체의 합성을 위한 활성 화합물로서 매우 가치 있는 것이다. 앞으로 이들을 기본 구조로 하여 신규 ALS 저해 제초제의 개발을 위한 유도체의 합성에 이용되었으면 한다.
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