메타게놈(metagenome)은 연구실에서 배양이 불가능한 미생물을 포함한 자연계에 존재하는 미생물의 유전자를 직접 연구하는 학문분야이다. 지구상 거의 모든 자연, 인공 환경에서 살고 있는 미생물 DNA를 분리 정제하는 것이 가능하며, 재조합 DNA 기술 등을 이용하여 배양 가능한 숙주미생물에 메타지놈을 클로닝함으로서 메타지놈 라이브러리를 제작할 수 있다. 최근 메타게노믹스를 통하여 자연계에 존재하고 있는 대다수의 미생물들이 실험실에서 배양되지 않았던 이유를 구명할 수 있게 되었고, 그들이 가지고 있는 생태학적인 의미와 역할에 대한 이해와 더불어 점차 그 응용 분야와 범위도 확대되고 있다. 이와 같은 메타게놈의 응용 분야 확대의 한 방안으로 본 연구에서는 새로운 제초활성 물질 및 제초활성 물질 생산에 필요한 유전자를 확보하기 위해 메타게놈 라이브러리를 대상으로 오이 떡잎절편 검정, 미세조류 생장저해 검정, 종자발아 저해 검정의 HTS (high throughput screening) 시스템을 구축하였고, 구축된 시스템으로부터 선발된 최종 단일 클론인 9-G1과 9-G12의 바랭이에 대한 in vivo assay를 통해 본 연구에서 개발한 HTS 시스템의 유효성을 확인 하였다. 후속연구로서 활성단일클론이 만들어내는 제초활성물질의 동정 및 제초활성물질을 합성하는 유전자군에 대한 연구를 수행 중에 있다.
메타게놈(metagenome)은 연구실에서 배양이 불가능한 미생물을 포함한 자연계에 존재하는 미생물의 유전자를 직접 연구하는 학문분야이다. 지구상 거의 모든 자연, 인공 환경에서 살고 있는 미생물 DNA를 분리 정제하는 것이 가능하며, 재조합 DNA 기술 등을 이용하여 배양 가능한 숙주미생물에 메타지놈을 클로닝함으로서 메타지놈 라이브러리를 제작할 수 있다. 최근 메타게노믹스를 통하여 자연계에 존재하고 있는 대다수의 미생물들이 실험실에서 배양되지 않았던 이유를 구명할 수 있게 되었고, 그들이 가지고 있는 생태학적인 의미와 역할에 대한 이해와 더불어 점차 그 응용 분야와 범위도 확대되고 있다. 이와 같은 메타게놈의 응용 분야 확대의 한 방안으로 본 연구에서는 새로운 제초활성 물질 및 제초활성 물질 생산에 필요한 유전자를 확보하기 위해 메타게놈 라이브러리를 대상으로 오이 떡잎절편 검정, 미세조류 생장저해 검정, 종자발아 저해 검정의 HTS (high throughput screening) 시스템을 구축하였고, 구축된 시스템으로부터 선발된 최종 단일 클론인 9-G1과 9-G12의 바랭이에 대한 in vivo assay를 통해 본 연구에서 개발한 HTS 시스템의 유효성을 확인 하였다. 후속연구로서 활성단일클론이 만들어내는 제초활성물질의 동정 및 제초활성물질을 합성하는 유전자군에 대한 연구를 수행 중에 있다.
Metagenomics is a powerful tool to isolate novel biocatalyst and biomolecules directly from the environmental DNA libraries. Since the metagenomics approach bypasses cultivation of microorganisms, un-cultured microorganisms that are majority of exists can be the richest reservoir for natural product...
Metagenomics is a powerful tool to isolate novel biocatalyst and biomolecules directly from the environmental DNA libraries. Since the metagenomics approach bypasses cultivation of microorganisms, un-cultured microorganisms that are majority of exists can be the richest reservoir for natural products discovery. To discover novel herbicidal substances from soil metagenome, we established three easy, simple and effective high throughput screening methods such as cucumber cotyledon leaf disc assay, microalgae assay and seed germination assay. Employing the methods, we isolated two active single clones (9-G1 and 9-G12) expressing herbicidal activity which whitened leaf discs, inhibited growth of microalgae and inhibited root growth of germinated Arabidopsis seeds. Spraying butanol fraction of the isolated active clones' culture broth led to growth retardation or desiccation of Digitalia sanguinalis (L) Scop. in vivo. These results represent that the screening methods established in this study are useful to screen herbicidal substances from metagenome libraries. Further identifying molecular structure of the herbicidal active substances and analyzing gene clusters encoding synthesis systems for the active substances are in progress.
Metagenomics is a powerful tool to isolate novel biocatalyst and biomolecules directly from the environmental DNA libraries. Since the metagenomics approach bypasses cultivation of microorganisms, un-cultured microorganisms that are majority of exists can be the richest reservoir for natural products discovery. To discover novel herbicidal substances from soil metagenome, we established three easy, simple and effective high throughput screening methods such as cucumber cotyledon leaf disc assay, microalgae assay and seed germination assay. Employing the methods, we isolated two active single clones (9-G1 and 9-G12) expressing herbicidal activity which whitened leaf discs, inhibited growth of microalgae and inhibited root growth of germinated Arabidopsis seeds. Spraying butanol fraction of the isolated active clones' culture broth led to growth retardation or desiccation of Digitalia sanguinalis (L) Scop. in vivo. These results represent that the screening methods established in this study are useful to screen herbicidal substances from metagenome libraries. Further identifying molecular structure of the herbicidal active substances and analyzing gene clusters encoding synthesis systems for the active substances are in progress.
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문제 정의
본 실험에서는 기존 연구 결과를 참고하여 검정용 미세 조류로 Chlorella vulgaris와 Scenedesmus accuminatus를 사용하여 상기 오이떡잎절편 검정법을 통해 백화현상을 유도한 8종류의 단일 클론에 의한 조류의 생장저해 활성이 나타나는지 확인하였다. 이때 오이떡잎절편에 활성이 없었던 4-D1과 4-D5 단일 클론을 음성 대조군으로 사용 하였다.
제초활성이 있는 메타게놈 배양액이 토양내 식물 종자의 발아에 미치는 영향을 예측하기 위한 실험으로 애기장대종자의 in vitro 발아 시험을 수행 하였다. 애기장대 에코타입 콜럼비아(Arabidopsis thaliana Col-0) 종자를 24 well plate 한 웰당 일정한 개수의 종자가 들어가도록 분주하고 종자 위에 제초 활성을 나타내는 메타게놈 클론 배양액을 100 µl 씩 첨가하고 정치배양 하면서 일주일 후, 발아율 및 발아 상태를 관찰하였다.
제안 방법
메타게놈 배양액 처리를 위해서는 배양한 미세조류를 OD673 = 1 되도록 희석 하고 메타게놈 배양액과 1:1 비율로 섞은 뒤 25°C, 16 h/8 h (light/dark) 조건에서 배양 하며 673 nm에서 흡광도의 변화를 확인 함으로써 생장 변화를 관찰하였다. 96 well plate를 사용 하는 경우 microplate reader (xMark Microplate Spectrophotometer, BIO-RAD)를 이용하여 동일한 파장에서 관찰하고 처리 당일의 흡광도와 이틀 또는 삼일 후의 흡광도를 비교 하였다.
9일 동안 온실에서 생육시킨 오이 떡잎을 70% 에탄올 용액에 담가 살균한 뒤 여과지(filter paper)를 사용하여 실온건조 하였다. 건조한 떡잎에 지름 5 mm 콜크보러(corkborer)를 이용하여 엽 절편을 분리하여 사용하였다.
따라서 그림 1의 첫 번째 스크리닝에서 선택한 A9 풀에 특별히 오이 떡잎절편의 백화현상을 유도하는 클론이 하나 이상 포함되어 있을 것이므로 A9 풀로부터 3000개의 콜로니(colony) 즉, 단일 클론을 분리 하여 96 well plate (1 colony well-1)에 각각 접종 하고 배양 하였다. 각 웰 당 단일 클론으로 존재할 것으로 판단되는 메타게놈 배양액을 가지고 동일한 실험을 수행하였고, Fig. 2에 나타낸 바와 같이 7-A5, 7-G9, 8-D8, 8-D9, 9-A5, 9-E11, 9-G1, 9-G12를 포함한 강력한 탈색 효과를 나타나게 하는 클론을 확인하였다(Fig. 2). 상기 여덟 종류의 단일 클론은 다른 종류의 검정법을 통해 제초활성을 확인하였다.
메타게놈 배양액 처리를 위해서는 배양한 미세조류를 OD673 = 1 되도록 희석 하고 메타게놈 배양액과 1:1 비율로 섞은 뒤 25°C, 16 h/8 h (light/dark) 조건에서 배양 하며 673 nm에서 흡광도의 변화를 확인 함으로써 생장 변화를 관찰하였다.
메타게놈 배양액은 멸균 한 뒤 상징액만을 사용하였으며 애기장대종자가 파종된 각 well당 100 µl 씩 분주하여 무균상태로 자연건조 하였다.
메타게놈으로부터 합성되는 제초활성물질을 찾기 위하여 그림 1에 나타낸 방법과 같이 오이 떡잎절편을 이용하여 잎의 황화, 백화 또는 괴사 등의 증상을 유발하는 클론을 스크리닝 하였고, 세 번 이상의 반복실험을 통해 백화 현상을 나타내게 하는 A9 위치를 1차 선택 하였다(Fig. 1). 본 연구 그룹에서 보유하고 있는 메타게놈라이브러리의 경우 96 well plate 에 보관 중이며 각 well 에는 약 3000 종류의 서로 다른 클론이 포함된 풀(pool) 단위로 구성되어 있다.
)를 파종하여 온실(30/20±5°C, Light/Dark = 14/10 h)에서 9일 동안 생육시킨 뒤 사용 하였다. 배양액 또는 배양액의 분획물을 포트당 5 mL으로 분무 처리하고 동일한 온실에서 관리 하며 처리 후 1일부터 5일 까지 외형적인 증상을 달관 조사 하였다.
chloramphenicol, SIGMA) 배지를 사용하여 37°C에서 3일간 진탕배양 하였다. 배양액 분획 시 우선 배양액을 가압멸균(121℃ 에서 15분간 autoclave) 한 것을 원심분리 하여 상징액을 확보한 후 butanol 과 1:1 (v/v)로 섞고 분획용 funnel 에서 butanol 분획 만을 획득했다. Butanol 분획은 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA, Japan)를 사용하여 완전히 건조시킨 뒤 원 배양액 부피의 1/100이 되도록 40% acetone에 녹였다.
배양액을 처리한 종자를 포함한 24 well plate는 밀봉하여 뒤 25°C, 16 h/8 h (light/dark) 조건의 생장 상에서 배양하며 발아 여부 및 발아 후 생장과정을 관찰하였다.
상기 실험을 통하여 생장저해 효과를 나타내는 선발된 단일 클론의 실제 식물체에 대한 살초효과를 확인 하기 위해 5종의 선발클론(8-D9, 9-A5, 9-E11, 9-G1 and 9-G12)을 대량배양(1 L) 한 후 배양액의 염분 제거를 위해 butanol 분획만을 농축하여 바랭이(D. sanguinalis)에 경엽처리 하였다. Fig.
애기장대 에코타입 콜럼비아(Arabidopsis thaliana Col-0) 종자를 24 well plate 한 웰당 일정한 개수의 종자가 들어가도록 분주하고 종자 위에 제초 활성을 나타내는 메타게놈 클론 배양액을 100 µl 씩 첨가하고 정치배양 하면서 일주일 후, 발아율 및 발아 상태를 관찰하였다.
본 실험에서는 기존 연구 결과를 참고하여 검정용 미세 조류로 Chlorella vulgaris와 Scenedesmus accuminatus를 사용하여 상기 오이떡잎절편 검정법을 통해 백화현상을 유도한 8종류의 단일 클론에 의한 조류의 생장저해 활성이 나타나는지 확인하였다. 이때 오이떡잎절편에 활성이 없었던 4-D1과 4-D5 단일 클론을 음성 대조군으로 사용 하였다. 충분히 배양한 두 종류의 조류 배양액을 96 well plate에 분주하고 동일 부피의 메타게놈 배양액을 처리한 뒤 처리 당일과 2일 후 673 nm에서 조류 흡광도의 변화를 살펴본 결과 오이떡잎절편에 백화현상을 야기한 단일클론 모두 흡광도의 변화를 야기하지 않았거나 감소시켜 조류의 생장을 억제하는 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
최근 메타게노믹스를 통하여 자연계에 존재하고 있는 대다수의 미생물들이 실험실에서 배양되지 않았던 이유를 구명할 수 있게 되었고, 그들이 가 지고 있는 생태학적인 의미와 역할에 대한 이해와 더불어 점차 그 응용 분야와 범위도 확대되고 있다. 이와 같은 메타게놈의 응용 분야 확대의 한 방안으로 본 연구에서는 새로운 제초활성 물질 및 제초활성 물질 생산에 필요한 유전자를 확보하기 위해 메타게놈 라이브러리를 대상으로 오이 떡잎절편 검정, 미세조류 생장저해 검정, 종자발아 저해 검정의 HTS (high throughput screening) 시스템을 구축하였고, 구축된 시스템으로부터 선발된 최종 단일 클론인 9-G1 과 9-G12의 바랭이에 대한 in vivo assay를 통해 본 연구에서 개발한 HTS 시스템의 유효성을 확인 하였다. 후속연구로서 활성단일클론이 만들어내는 제초활성물질의 동정 및 제초활성물질을 합성하는 유전자군에 대한 연구를 수행 중에 있다.
상기 96 well plate는 투명한 플레이트 실(plate seal)로 밀봉하고 뚜껑을 덮은 후 다시 랩으로 밀봉하여 25°C 생장상(Lignt/dark = 16 h/8 h)에서 배양하였다. 처리 5일 또는 7일 동안 배양한 오이 잎 절편의 상태변화를 육안으로 관찰하였고 엽절편의 색이 황화, 백화 또는 괴사하는 과정을 평가하여 활성이 있는 위치의 배양액을 선택하였다.
대상 데이터
9일 동안 온실에서 생육시킨 오이 떡잎을 70% 에탄올 용액에 담가 살균한 뒤 여과지(filter paper)를 사용하여 실온건조 하였다. 건조한 떡잎에 지름 5 mm 콜크보러(corkborer)를 이용하여 엽 절편을 분리하여 사용하였다. 96 well plate에서 배양한 뒤 가압멸균한 메타게놈 배양액 상징액 50 µl 씩을 96 well plate에 분주하고 살균된 오이 잎 절편을 한 웰(well)당 하나씩 배양액 위에 띄웠다.
두 종류의 미세조류 Scenedesmus accuminatus와 Chlorella vulgaris를 사용하였고, 두 종류의 조류는 메타게놈 배양액 처리 이전에 Allen’s media (Allen, 1952) 에서 5일간 진탕 배양 하였다.
메타게놈 배양액의 식물 종자 발아에 미치는 영향을 알아보기 위해 애기장대(Arabidopsis thaliana) Col-0의 종자를 사용하였다. 애기장대종자는 sodium hypochloride로 살균하고 무균상태로 건조한 뒤 MS agar media를 1 mL씩 분주한 24 well plate에 각 well 당 10~15립씩 파종하였다.
메타게놈라이브러리를 보유하고 있는 Escherichia coli EP100은 1/2 농도의 LB broth (Duchefa, The Netherlands) + Cm34 (34 µg mL-1 chloramphenicol, SIGMA) 배지를 사용하여 37°C에서 3일간 진탕배양 하였다.
1). 본 연구 그룹에서 보유하고 있는 메타게놈라이브러리의 경우 96 well plate 에 보관 중이며 각 well 에는 약 3000 종류의 서로 다른 클론이 포함된 풀(pool) 단위로 구성되어 있다. 따라서 그림 1의 첫 번째 스크리닝에서 선택한 A9 풀에 특별히 오이 떡잎절편의 백화현상을 유도하는 클론이 하나 이상 포함되어 있을 것이므로 A9 풀로부터 3000개의 콜로니(colony) 즉, 단일 클론을 분리 하여 96 well plate (1 colony well-1)에 각각 접종 하고 배양 하였다.
성능/효과
sanguinalis)에 경엽처리 하였다. Fig. 3 및 Table 2에 나타낸 바와 같이, 메타게놈 배양액을 처리한 바랭이 군에서는 처리 2일 후부터 육안으로 관찰이 가능했으며, 선발된 활성 단일 클론의 배양액을 처리한 군과 음성 대조군(4-D1, 4-D5 and media)을 비교하였을 때, 선발된 단일 클론의 살초 효과를 관찰 할 수 있었다. 8-D9, 9-A5, 9-E11의 경우 음성대조군과 비교 할 때 확실히 증가한 살초효과를 나타내지는 않았으나 9-G1과 9-G12 클론 배양액의 경우 90%의 살초 효과를 나타냈다(Fig.
3 and Table 2). 결과적으로 9-G1과 9-G12를 최종 살초효과를 나타내는 단일 클론으로 선택할 수 있었다.
그 결과, Table 1에 나타낸 바와 같이, 8-D9를 제외한 모든 처리구에서 발아율 자체에 미치는 영향은 없었고 다만 발아 후 자라난 뿌리의 길이에서 다소 차이를 나타냈다. 음성대조군으로 사용한 4-D1과 8-D6의 경우에도 뿌리 생장이 저해 되었고 배지만을 처리한 경우에만 정상적인 뿌리 생장이 이루어졌다.
따라서 오이 떡잎절편검정, 미세조류 생장저해검정, 종자발아저해검정 등을 통해 광범위한 메타게놈 라이브러리로부터 제초활성이 있는 단일클론의 스크리닝이 가능하며, 선별한 단일 클론을 실제 식물체에 적용했을 때 에도 충분한 활성을 관찰 할 수 있음을 확인하였다. 현재 선별한 메타게놈 단일 클론이 합성하는 제초활성 물질의 동정과 단일 클론의 유전자 서열을 분석하여 제초활성 물질을 합성 하는데 필요한 유전자군의 구조 분석을 진행 중에 있다.
). 반면 음성 대조군으로 사용한 4-D1과 4-D5, 8-D8, 메타게놈 배양용 배지(LB), 메타게놈 호스트 배양액(EP100)의 경우 흡광도가 크게 증가하여 상대적으로 조류 생장억제 활성이 낮거나 없는 것으로 나타났다(Fig. 2.). 조류 생장저해 검정법의 경우 96 well plate등의 microplate 사용이 용이하고 식물 시험을 하는 경우 보다 검정 시간이 비교적 짧은 편이며 시험 반복수를 최대화 할 수 있으므로 대량의스크리닝에는 가장 적합한 방법이라고 할 수 있다.
이때 오이떡잎절편에 활성이 없었던 4-D1과 4-D5 단일 클론을 음성 대조군으로 사용 하였다. 충분히 배양한 두 종류의 조류 배양액을 96 well plate에 분주하고 동일 부피의 메타게놈 배양액을 처리한 뒤 처리 당일과 2일 후 673 nm에서 조류 흡광도의 변화를 살펴본 결과 오이떡잎절편에 백화현상을 야기한 단일클론 모두 흡광도의 변화를 야기하지 않았거나 감소시켜 조류의 생장을 억제하는 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2.). 반면 음성 대조군으로 사용한 4-D1과 4-D5, 8-D8, 메타게놈 배양용 배지(LB), 메타게놈 호스트 배양액(EP100)의 경우 흡광도가 크게 증가하여 상대적으로 조류 생장억제 활성이 낮거나 없는 것으로 나타났다(Fig.
후속연구
, 2006; Simon and Daniel, 2011). 따라서 본 연구는 전식물체(in vivo or in planta) 적용 이전에 간단히 메타게놈 유래 살초활성 물질을 스크리닝 할 수 있는 오이떡잎절편검정법, 미세조류생장저해검정법, 식물종자발아검정법을 구축하였고, 구축한 세 가지 스크리닝 방법은 앞으로 메타게놈 또는 큰 사이즈의 라이브러리를 대상으로 한 살초활성물질 스크리닝 시 high throughput screening (HTS) 시스템으로 유용한 방법이 될 수 있을 것이다.
상대적으로 7-A5, 7-G9, 8-D8의 경우 다른 처리구에 비해 뿌리 생장이 저해 되었다(Table 1). 따라서 식물종자 발아저해 검정법은 대장균이 배양된 배양액을 단독으로 사용 할 경우 발아율이나 생장저해를 관찰하기에 명확한 방법으로 사용될 수는 없으며 다른 검정법과 함께 사용하여 특징을 비교해야 할 것으로 생각된다.
, 2013). 만약 본 연구를 통해 선발된 클론에 의해 만들어진 제초활성물질이 밝혀진다면 메타게놈에서 유래된 최초의 물질이 될 것으로 기대하고 있다.
, 2009), glufosinate-ammonium (Hoerlein, 1994) 등이 알려져 있다. 이와 같이 다양한 미생물 유래 제초제가 개발되었지만 bialaphos의 경우 범용 경쟁제품 개발로 경쟁력이 약화 되었고, bialaphos의 유용 성분을 합성한 제초제인 glufosinate-ammonium의 경우 다른 비선택성 제초제에 비해 상대적으로 높은 가격으로 시장경쟁력이 약화되고 있기 때문에 잡초의 효율적 관리를 위한 새로운 제초활성물질에 대한 탐색은 계속 되어야 할 것 이다.
이와 같은 메타게놈의 응용 분야 확대의 한 방안으로 본 연구에서는 새로운 제초활성 물질 및 제초활성 물질 생산에 필요한 유전자를 확보하기 위해 메타게놈 라이브러리를 대상으로 오이 떡잎절편 검정, 미세조류 생장저해 검정, 종자발아 저해 검정의 HTS (high throughput screening) 시스템을 구축하였고, 구축된 시스템으로부터 선발된 최종 단일 클론인 9-G1 과 9-G12의 바랭이에 대한 in vivo assay를 통해 본 연구에서 개발한 HTS 시스템의 유효성을 확인 하였다. 후속연구로서 활성단일클론이 만들어내는 제초활성물질의 동정 및 제초활성물질을 합성하는 유전자군에 대한 연구를 수행 중에 있다.
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