신경세포 가지돌기가시의 형태를 분석하는 것은 신경세포의 기능을 이해하는데 중요하다. 가지돌기가시는 광학현미경해상도의 한계근처에 있는 구조물로 투과전자현미경 및 공초점헌미경 등을 이용한 연구들이 보고 되고 있다. 고압전자현미경은 높은 해상도와 투과능력 덕분에 두꺼운 절편의 관찰이 용이하여 신경세포의 가지돌기가시 등을 관찰하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 고압전자현미경을 이용하여 신경세포의 가지돌기가시를 효과적으로 관찰하는방법을 확인하고 기본적인 형태학적 자료를 축적하고자 하였다. 생쥐 소뇌에 위치하는 조롱박세포의 가지돌기가시를 anti-calbindin 28kD항체 및 Golfi 염색으로 표지한 후 $4{\mu}m$두께의 절편을 제작하여 impregnation방법으로 각각 처리하여 표본을 제작한 후, 초고압전자현미경으로 관찰하여 효과적인 관찰방법을 찾고, 영상분석 기법을 이용하여 가지돌기가시의 밀도와 가시의 길이를 측정하였다. 초고압전자현미경 관찰 결과, 면역조직화학법과 Golgi법 모두 조롱박세포의 가지돌기가시를 관찰할 수 있었으나 Golgi법으로 준비된 표본이 가시를 정량적으로 분석하기에 더욱 적합하였다. 명상분석 결과로는 가지돌기 가시의 평균밀도가 $24.5{\pm}3.6$개/$10{\mu}m$였고, 가시의 평균길이는 $1.12{\pm}0.22{\mu}m$였다. 본 연구를 통해서 Gogli 법으로 염색된 조롱박세포를 고압전자현미경으로 관찰할 경우, 가지돌기가시를 정량적으로 관찰할만한 만족스러운 영상을 얻을 수 있었고, 추후 경사를 주어 촬영한 두 장의 사진을 이용하여 3차원적으로 분석하면 좀 더 정확한 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단되며, 이는 소뇌의 신경가소성을 이해하는데 중요한 자료가 될 것이다.
신경세포 가지돌기가시의 형태를 분석하는 것은 신경세포의 기능을 이해하는데 중요하다. 가지돌기가시는 광학현미경 해상도의 한계근처에 있는 구조물로 투과전자현미경 및 공초점헌미경 등을 이용한 연구들이 보고 되고 있다. 고압전자현미경은 높은 해상도와 투과능력 덕분에 두꺼운 절편의 관찰이 용이하여 신경세포의 가지돌기가시 등을 관찰하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 고압전자현미경을 이용하여 신경세포의 가지돌기가시를 효과적으로 관찰하는방법을 확인하고 기본적인 형태학적 자료를 축적하고자 하였다. 생쥐 소뇌에 위치하는 조롱박세포의 가지돌기가시를 anti-calbindin 28kD항체 및 Golfi 염색으로 표지한 후 $4{\mu}m$두께의 절편을 제작하여 impregnation방법으로 각각 처리하여 표본을 제작한 후, 초고압전자현미경으로 관찰하여 효과적인 관찰방법을 찾고, 영상분석 기법을 이용하여 가지돌기가시의 밀도와 가시의 길이를 측정하였다. 초고압전자현미경 관찰 결과, 면역조직화학법과 Golgi법 모두 조롱박세포의 가지돌기가시를 관찰할 수 있었으나 Golgi법으로 준비된 표본이 가시를 정량적으로 분석하기에 더욱 적합하였다. 명상분석 결과로는 가지돌기 가시의 평균밀도가 $24.5{\pm}3.6$개/$10{\mu}m$였고, 가시의 평균길이는 $1.12{\pm}0.22{\mu}m$였다. 본 연구를 통해서 Gogli 법으로 염색된 조롱박세포를 고압전자현미경으로 관찰할 경우, 가지돌기가시를 정량적으로 관찰할만한 만족스러운 영상을 얻을 수 있었고, 추후 경사를 주어 촬영한 두 장의 사진을 이용하여 3차원적으로 분석하면 좀 더 정확한 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단되며, 이는 소뇌의 신경가소성을 이해하는데 중요한 자료가 될 것이다.
The morphological features of neuronal dendritic spines are changed their shapes, sizes and density in response to physiological or pathological conditions . Therefore, exact analysis of spines warrants understanding of neuronal function. The size of the spine is at the borderline of resolution with...
The morphological features of neuronal dendritic spines are changed their shapes, sizes and density in response to physiological or pathological conditions . Therefore, exact analysis of spines warrants understanding of neuronal function. The size of the spine is at the borderline of resolution with light microscopy. High voltage electron microscopy Provide excellent resolution of the spines with proper stain techniques thanks to its higher resolution and penetration power. We evaluated more effective staining method for observing dendritic spines after labeling Purkinje cells with anti-calbindin 28 kD immunohistochemistry or Golgi staining methods. 4 fm thickness sections were observed with high voltage electron microscopy and some morphometric analyses were performed. Both Golgi staining and immunohistochemistry revealed the detail structures of the Purkinje cell such as soma, dendrites, and dendritic spines. High voltage electron micrographs with Golgi staining provide more precise morphology and are easy to measure. Average density of spine is $24.5{\pm}3.6/10{\mu}m$ and its length is $1.12{\pm}0.22{\mu}m$. For quantitative analysis of the spines, high voltage electron, micrographs with Golgi staining are more effective. This preliminary result is expected to be useful for further study of spine plasticity in various conditions.
The morphological features of neuronal dendritic spines are changed their shapes, sizes and density in response to physiological or pathological conditions . Therefore, exact analysis of spines warrants understanding of neuronal function. The size of the spine is at the borderline of resolution with light microscopy. High voltage electron microscopy Provide excellent resolution of the spines with proper stain techniques thanks to its higher resolution and penetration power. We evaluated more effective staining method for observing dendritic spines after labeling Purkinje cells with anti-calbindin 28 kD immunohistochemistry or Golgi staining methods. 4 fm thickness sections were observed with high voltage electron microscopy and some morphometric analyses were performed. Both Golgi staining and immunohistochemistry revealed the detail structures of the Purkinje cell such as soma, dendrites, and dendritic spines. High voltage electron micrographs with Golgi staining provide more precise morphology and are easy to measure. Average density of spine is $24.5{\pm}3.6/10{\mu}m$ and its length is $1.12{\pm}0.22{\mu}m$. For quantitative analysis of the spines, high voltage electron, micrographs with Golgi staining are more effective. This preliminary result is expected to be useful for further study of spine plasticity in various conditions.
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제안 방법
, 1 :400)로 2시간 정도 반응시키고 horseradish peroxidase - labeled streptoavidin 용액으로 1 시간 처리하였다. 0.05% DAB오+ 0.006% H2O2로 발색반응을 10〜20분간 시행하였다. 발색을 확인한 다음 1% osmium tetroxide용액에 2시간 후 고정하였고 1% uranyl acetate로 전자염색한 후 탈수과정을 거쳐 Epon-Araldite mixture에 포매하여 Golgi염색에서 기술한 방법과 동일하게 절편을 제작하여 관찰하였다.
1% glutaraldehyde를 이용하여 관류 고정하였으며 소뇌를 적출하여 동일 고정액에 16시간 정도 후 고정하였다. 30% sucrose용액에 조직 이 가라앉을 때까지 기다린 후 꺼내어 액체질소에 약 20〜30초간 담갔다가 꺼내어 녹인 후 Vibratome-g- 이용해 30~200 jim 의 시상절편을 제작하였다. 절편을 PBS 완충액으로세척하고 normal goat serum, 2% bovine serum albu-min 등을 거쳐서 비특이적 면역반응을 감소시킨 다음에 calbindin-28kD 항체 (Sigma, MO)를 1: 30, 000으로 희석하여 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, PBS 완충액으로 10분씩 3〜4회 세척하여 biotin-labeled anti mouse IgG (Vector Lab.
PROD계의 웅성 생쥐 3마리를 Nembutal(50mg/kg) 을 복강 투여 하여 마취 한 후 4% paraformaldehyde와 0.1% glutaraldehyde를 이용하여 관류 고정하였으며 소뇌를 적출하여 동일 고정액에 16시간 정도 후 고정하였다. 30% sucrose용액에 조직 이 가라앉을 때까지 기다린 후 꺼내어 액체질소에 약 20〜30초간 담갔다가 꺼내어 녹인 후 Vibratome-g- 이용해 30~200 jim 의 시상절편을 제작하였다.
, 1999a). 가시의 밀도는 가지돌기 10 pm당 가시 의 수로 표기 하였고, 모든 가지 돌기 가시의 측정은 3차 분지 수준에서 시행되었다.
006% H2O2로 발색반응을 10〜20분간 시행하였다. 발색을 확인한 다음 1% osmium tetroxide용액에 2시간 후 고정하였고 1% uranyl acetate로 전자염색한 후 탈수과정을 거쳐 Epon-Araldite mixture에 포매하여 Golgi염색에서 기술한 방법과 동일하게 절편을 제작하여 관찰하였다.
본 연구는 소뇌 조롱박세포의 가지돌기가시를 Golgi 방법과 항calbidin-28kD항체를 이용하여 표지한 후 광학현미경과 고압전자현미경을 이용하여 비교 관찰하였다. Golgi 염색은 고전적인 염색기법이나아직까지 그 원리를 완전히 알지 못하고 있어 표준화된 조건을 잡기가 쉽지 않으며 불특정 다수의 세포가 염색되어 원하는 세포가 항상 염색되는 것은아니다 (Rhyu et al.
본 연구에서는 2, 000배로 촬영한 고압 전자현미경 사진 중 측정 이 용이한 가지돌기를 무작위로 측정하여 실험적 수준의 계측결과를 얻었다. 생쥐의 조롱박세포의 가지돌기가시의 평균 밀도는 가지돌기 10 nm 당 24.
생후 6개월 된 PROD 계의 3마리의 건강한 웅성 생쥐를 Nembutal (50 mg/kg)을 복강 투여하여 마취한 후 4% paraformaldehyde를 이용하여 관류고정하였다. 소뇌를 적출하여 2% paraformaldehyde와 2.
활주형 박절기를 이용하여 포매된 조직으로부터 501의 절편을 제작한 후 유리 슬라이드위에 재포매하여 광학현미경으로 관찰하였으며, 적절하게 염색된 절편을 선택하였다. 선택된 절편을 Epon-Araldite블록에 순간접착제를 이용하여 부착하였고, 3〜4jxm의 절편을 제작하여 75 mesh double copper grid에 올린 후 일본 국립 생리 연구소(NIPS, Okazaki, Japan)에 있는 고압 전자현미경 (Hitachi H-1250M)으로 가속전압 1000 kV에서 관찰하였다.
소뇌 조롱박세포 가지돌기가시의 정량적 분석척도로 가시의 밀도와 길이를 측정하였다. 얻어진.
관류고정하였다. 소뇌를 적출하여 2% paraformaldehyde와 2.5% glu- taraldehyde 에 하룻밤 동안 후고정한 후 3〜4 mm의 시상 절편을 제작하고 0.1 M cacodylate buffer로 수세하였다. 이어서 2.
Golgi 염색의 경우 7일 정도가 소요되지만, 면역염색은 2- 3일 정도만 필요하다. 시간절약과 특이적 표지가 가능한 면역염색기법을 고압전자현미경 관찰에 활용 가능성을 확인하였고 기존에 활용되어 온 Golgi 염색 방법과 비교하였다.
조롱박세포의 가지돌기가시는 조롱박세포로 들어오는 정보를 일차적으로 수용하여 처리하는 기능을 수행하고 있어 소뇌의 적절한 기능수행을 위해 중요한 구조물이다. 이에 본 연구에서는 PROD 계 마우스를 calbindin항체를 이용한 면역조직화학 법과 Golgi 염색방법으로 각각 처리하여 표본을 제작하고 고압전자현미경으로 관찰하여 효과적인 관찰 방법을 찾고 영상분석 기법을 이용하여 가지돌기 가시의 밀도와 가시의 길이를 측정하였다.
30% sucrose용액에 조직 이 가라앉을 때까지 기다린 후 꺼내어 액체질소에 약 20〜30초간 담갔다가 꺼내어 녹인 후 Vibratome-g- 이용해 30~200 jim 의 시상절편을 제작하였다. 절편을 PBS 완충액으로세척하고 normal goat serum, 2% bovine serum albu-min 등을 거쳐서 비특이적 면역반응을 감소시킨 다음에 calbindin-28kD 항체 (Sigma, MO)를 1: 30, 000으로 희석하여 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, PBS 완충액으로 10분씩 3〜4회 세척하여 biotin-labeled anti mouse IgG (Vector Lab., 1 :400)로 2시간 정도 반응시키고 horseradish peroxidase - labeled streptoavidin 용액으로 1 시간 처리하였다. 0.
얻어진. 필름을스캐너를 통하여 Tiff 형태로 저장하여 Rhyu 등의 방법에 따라 NIH 영상 분석 프로그램을 이용하여 측정하였다 (Rhyu et al., 1999a). 가시의 밀도는 가지돌기 10 pm당 가시 의 수로 표기 하였고, 모든 가지 돌기 가시의 측정은 3차 분지 수준에서 시행되었다.
그 후 통상적인 방법으로 탈수과정을 거쳐 Epon-Araldite mixture 에 포매하였다. 활주형 박절기를 이용하여 포매된 조직으로부터 501의 절편을 제작한 후 유리 슬라이드위에 재포매하여 광학현미경으로 관찰하였으며, 적절하게 염색된 절편을 선택하였다. 선택된 절편을 Epon-Araldite블록에 순간접착제를 이용하여 부착하였고, 3〜4jxm의 절편을 제작하여 75 mesh double copper grid에 올린 후 일본 국립 생리 연구소(NIPS, Okazaki, Japan)에 있는 고압 전자현미경 (Hitachi H-1250M)으로 가속전압 1000 kV에서 관찰하였다.
성능/효과
Golgi 염색으로 준비된 시료가 가지돌기가시의 정량분석에 용이한 것으로 판단되 어 NIH 영상 분석 프로그램을 이용하여 561 [im의 가지돌기 위에 위치한 1, 354개의 가지돌기가시를 분석한 결과 평균 24.5 ± 3.6개/10 (평균표준편차)로 나타났다. 위의 1, 354 개의 가지돌기가시 중 전체의 모습이 확실하게 나타나는 가시의 길이를 측정한 평균길이는 1.
Golgi 염색으로 표지된 가지돌기가시는 매우 뚜렷하여 쉽게 가시의 숫자와 길이를 파악할 수 있었다: 8, 000배 정도의 고배율로 관찰하게, 되면 면역 염색 방법과는 달리 가시 주변부에 다양한 크기의 원형 입자가 관찰되었다. 이는 가시 자체의 구조가 아니라 Golgi 염색과정에서 나타나는 반응산물의 침착으로생각된다 (Palay & Chan-Palay, 1974a).
고압전자현미경을 이용하여 1, 000배에서 관찰한 소견을 보면 Golgi염색과 면역화학반응 모두에서 광학현미경에 비하여 좀 더 자세히 관찰되었으며, 특히 Golgi염색의 경우 가지돌기가시가 분명하게 관찰되었다 (Fig. 1C, D).
광학 현미경적 소견을 살펴보면 Golgi염색과 면역화학 반응 모두에서 세포체와 가지돌기는 쉽게 확인되었고 가지돌기가시의 존재 사실을 확인 할 수 있었으며 Golgi 염색의 경우(Fig. 1A, B). 초점을 조절해가면서 관찰하면 가지돌기가시의 수를 셀 수 있었다.
또한 Hama와 Kosaka는 흰쥐의 조롱박세포 가시의 크기가 최대 1.5|xm까지 존재하는 것을 확인하여 보고 (1979)하였는데, 본 연구의 결과인 1.12±0.22보다 조금 크게 나타난 것은 입체적인 분석에 기인한 것이라고 판단되며, 입체상을 분석하면 좀 더 사실에 가까운 계측을 할 수 있을 것으로 판단된다.
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