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문제 정의
- 암의 유전자치료에서 암세포로의 선택적 유전자전달 매체의 부족은 치료효과의 감소를 야기하는 문제이다. 본 연구에서는 난소암 유전자치료의 효율을 높이기 위한 목적으로 난소암세포로 선택적인 유전자전달을 하도록 개량된 아데노바이러스 벡터를 제조하고, 그 효율성을 난소암세포주를 이용하여 조사하였다. 난소암세포에 과다발현하는 분자인 ErbB receptor를 표적하도록 아데노바이러스 외피단백질 fiber에 ErbB receptor에 대한 ligand인 heregulin으로부터 유래한 펩티드를 부착하였다.
- 본고에서는 난소암에서 과다 발현되는 것으로 알려진 ErbB receptor family를 표적분자로 선택하고, 이 분자와 결합력이 높은 리간드인 heregulinβ (HRGβ)를 fiber에 부착하여 아데노바이러스의 자연수용체 발현여부에 영향을 받지 않고 난소암세포를 선택적으로 감염하는 아데노바이스 벡터 전략의 타당성에 대해 기술하였다.
- 우리는 아데노바이러스의 자연적인 감염경로에서 결정적인 역할을 하는 fiber와 CAR의 결합을 배제하고, 암세포에 과다발현하는 단백질을 통하여 바이러스가 감염되도록 외피단백질인 fiber에 특정 분자와 결합하는 리간드를 부착할 수 있도록 변형시킨 아데노바이러스 벡터 카세트를 개발하였다(14). 이번 연구에서는 이 카세트를 기반으로 하여 난소암세포에서 과다 발현되는 표면 분자를 표적할 수 있는 아데노바이러스 벡터를 제작하고 난소암에 특이적으로 유전자를 전달할 수 있는지를 검증하였다. 본고에서는 난소암에서 과다 발현되는 것으로 알려진 ErbB receptor family를 표적분자로 선택하고, 이 분자와 결합력이 높은 리간드인 heregulinβ (HRGβ)를 fiber에 부착하여 아데노바이러스의 자연수용체 발현여부에 영향을 받지 않고 난소암세포를 선택적으로 감염하는 아데노바이스 벡터 전략의 타당성에 대해 기술하였다.
제안 방법
- AdLac과 HβE-AdLac을 MOI 5로 감염시킨 후 24시간 동안 배양한 HeLa 세포를 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 단백질 분해효소 억제제가 들어있는 용액에 넣고 4℃에서 10분간 반응시킨 후 10,000×g에서 10분간 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다.
- HRGβ EGF like domain에서 ErbB3 receptor와 결합력이 높은 것으로 밝혀진 아미노산 172부터 232까지의 암호부위를 쥐 신경조직으로부터 RT-PCR을 이용하여 증폭하였다.
- HRGβ의 EGF-like domain이 부착된 변형된 fiber가 세포 감염에 필수적인 trimer 구조를 형성하는지 확인하기 위하여 야생형 fiber를 가진 AdLac과 변형된 fiber를 가진 HβE-AdLac을 감염시킨 HeLa 세포를 이용하여 Fiber의 구조를 조사하였다(Fig. 2).
- 각 세포에서 발현되는 ErbB2와 ErbB3의 양은 세포 용출 단백질 30 μg을 8% SDS-PAGE로 분획하였으며, nitrocellulose membrane에 옮겨 anti-erbB2와 anti-erbB3 (모두 Santa Cruz, USA) 항체와 반응시킨 후, pico-enhanced chemiluminescence를 이용하여 확인하였다.
- 시킬 수 있는 전략으로 선택적 유전자전달 능력이 향상된 아데노바이러스를 제작하였다. 기존 1세대 아데노바이러스를 통한 유전자전달의 비효율성을 줄이고 난소암세포로의 선택적 유전자전달 효율을 높이기 위해 세포 수용체 CAR와 결합하여 아데노바이러스가 세포에 침투할 때 주된 역할을 하는 바이러스 외피단백질 fiber (2)를 변형시켰다(Fig. 1A).
- 본 연구에서는 난소암 유전자치료의 효율을 높이기 위한 목적으로 난소암세포로 선택적인 유전자전달을 하도록 개량된 아데노바이러스 벡터를 제조하고, 그 효율성을 난소암세포주를 이용하여 조사하였다. 난소암세포에 과다발현하는 분자인 ErbB receptor를 표적하도록 아데노바이러스 외피단백질 fiber에 ErbB receptor에 대한 ligand인 heregulin으로부터 유래한 펩티드를 부착하였다. 53개의 아미노산으로 구성된 외부 펩티드를 fiber에 부착하였을 때 바이러스 감염에 중요한 기능을 하는 fiber 삼량체 구조 형성에 영향을 미치지 않았다.
- 난소암의 유전자치료에서 치료 유전자의 전달 효율을 증가시킬 수 있는 전략으로 선택적 유전자전달 능력이 향상된 아데노바이러스를 제작하였다. 기존 1세대 아데노바이러스를 통한 유전자전달의 비효율성을 줄이고 난소암세포로의 선택적 유전자전달 효율을 높이기 위해 세포 수용체 CAR와 결합하여 아데노바이러스가 세포에 침투할 때 주된 역할을 하는 바이러스 외피단백질 fiber (2)를 변형시켰다(Fig.
- 다음으로 ß-galactosidase 효소활성 측정을 이용하여 fiber가 변형된 바이러스에 의한 유전자전달 효율이 야생형 fiber를 가진 1세대 바이러스에 비해 얼마나 향상되었는가를 정량적으로 조사하였다(Fig. 4).
- 따라서 HβE-AdLac에 유전자전달이 fiber에 부착한 HRGβ EGF-like domain에 의해 매개되는지를 알아보기 위하여 각 세포주에 발현하는 ErbB2와 ErbB3 receptor의 양을 조사하였다(Fig. 5).
- 모든 HRG isoform은 EGF-like domain을 갖고 있는데 이 부위만으로 ErbB receptor와 결합할 수 있다(3). 따라서 이와 같이 난소암 세포에 과다 발현하는 ErbB2, ErbB3 receptor와 그 ligand인 NRG-1 사이의 결합력을 바탕으로 종양세포로 표적되는 유전자전달 system을 고안하였다. In vitro binding system을 이용하여 ErbB receptor와 EGF를 포함한 여러 NRG-1 isotype에 있는 EGF-like domain간의 결합력을 측정한 일련의 연구결과에 따르면 ErbB3 receptor에 대해 HRGβ의 EGF domain이 가장 강하게 결합하는 것으로 밝혀졌다(12, 13).
- 변형된 Fiber를 가진 재조합아데노바이러스의 유전자전달 효율을 측정하기 위해 reporter gene으로 β-galactosidase를 발현하는 재조합아데노바이러스 HβE-AdLac을 제작하였다.
- 세포용출 단백질 10 μg을 환원조건[32.15 mM Tris-Cl; pH 6.8, 1% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 50 mM Dithiothreitol (DTT), 10% glycerol]에서 가열하거나(reducing condition), 비환원조건(DTT를 제외하고 환원조건과 같은 용액)에서 가열하지 않고(nonreducing condition) 준비하여 9% SDS SDS-PAGE로 분획한 후, nitrocellulose membrane에 옮겨 fiber에 대한 4D2.5항체와(7) 반응시켰으며 pico-enhanced chemiluminescence(Donjin Biotech, Korea)를 이용하여 확인하였다.
- 재조합 아데노바이러스는 293 세포에서 감염가(infectious unit)를 결정 한 다음 실험에 사용하였다. 세포의 종류에 따라 바이러스는 50부터 5,000 multiplicity of infection (MOI)로 2% FBS가 포함된 배지에서 2시간 동안 감염시키고 정상 배지로 갈아 준 다음 24시간 동안 배양하였다.
- 여러 종류의 암세포를 Lysis buffer (20 mM Tri-Cl; pH 7.5, 137 mM NaCl, 40 mM β-glycerophosphate, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mg/ml aprotinin, leupeptin, pepstatin A, 1.0 mg/ml AEBSF)로 용출시킨 후, 10,000×g에서 10분간 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다.
- 위의 염기서열을 갖는 cDNA를 아데노바이러스 C-말단에 특정 펩티드를 부착하도록 고안된 plasmid cassette에(14) 클론 한 후, pAdEasy1 vector (Stratagene, USA)의 야생형 fiber gene을 변형된 fiber cDNA로 대체하여 HβE-pAdEasy1 vector를 제작하였다.
- coli β-galactosidase를 발현하는 재조합 아데노바이러스 HβE-AdLac을 제작하였다. 이 바이러스는 PCR과 Western blot 분석을 통해 확인하였다.
- 이 바이러스를 부위 특이적 primer를 이용한 PCR로 조사하였을 때, HRGβ EGF-like domain이 부착되어 야생형 fiber보다 크기가 큰 변형 fiber 유전자를 확인하였다(Fig. 1C).
- 이번 연구에서는 HRGβ의 전체 EGF-like domain과 비슷한 결합력으로 ErbB3 receptor와 결합하는 것으로 알려진 HRGβ의 EGF-like domain 중 53개의 아미노산(HRGβ의 amino acid 177부터 229)만을 fiber에 부착시켰다.
- 그러나 난소암은 말기 상태에서도 대부분이 복강 내에 제한되어 진행되기 때문에 항암치료제의복강 내 주입과 같은 국부적 치료로 종양을 효율적으로 제거할 수 있는 가능성이 높다. 이번 연구에서는 난소암세포에 과다 발현되는 것으로 알려진 ErbB2, ErbB3 receptor를 목표로 하여 이와 결합할 수 있는 최소 부위인 EGF domain 중 53개 아미노산으로 구성된 암세포 표적 ligand를 바이러스 외피에 부착한 재조합 아데노바이러스 벡터를 개발하였다. 이 벡터를 이용할 때 난소암세포주로 외래 유전자를 선택적이고 효율적으로 전달할 수 있는 것을 확인하였다.
- 제조사의 방법에 따라 p-HβE-AdEasy1 vector를 이용하여 reporter gene으로 E. coli β-galactosidase를 발현하는 재조합 아데노바이러스 HβE-AdLac을 제작하였다.
대상 데이터
- 293세포와 LN319, DM54MG, U373MG는 ATCC (American Type of Cell Collection, USA)와 서울대학교 세포주은행에서 각각 분양 받아, 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, USA), 100 u/ml penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM 배지(Life Technologies, USA)에서 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다. MCF-7, SKOV3, OVCAR3 세포는 10% FBS, 100 u/ml penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM/F12 (50:50) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
- 조건으로 배양하였다. MCF-7, SKOV3, OVCAR3 세포는 10% FBS, 100 u/ml penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM/F12 (50:50) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
- Expression of β-galctosidase was shown in dark stained cells. MOIs used in this experiment were 50 for 293, 5000 for MCF7, and 1000 for LN319, U373MG, OVCAR3, SKOV3, respectively. Scale bars, 25 μm.
- 야생형 fiber를 가진 AdLac과(15) 변형된 fiber를 가진 HβE-AdLac은 293 세포에서 증폭시키고 CsCl 밀도구배원심분리에 의해 정제한 후 -80°C에 보관하였다. 재조합 아데노바이러스는 293 세포에서 감염가(infectious unit)를 결정 한 다음 실험에 사용하였다. 세포의 종류에 따라 바이러스는 50부터 5,000 multiplicity of infection (MOI)로 2% FBS가 포함된 배지에서 2시간 동안 감염시키고 정상 배지로 갈아 준 다음 24시간 동안 배양하였다.
이론/모형
- HβE-AdLac이 난소암 특이적으로 유전자전달을 하는지 측정하기 위해 난소암 세포주를 포함한 다양한 종류의 암세포주에서 바이러스에 의한 β-galactosidase 발현을 X-gal 염색법으로 측정하였다(Fig. 3).
성능/효과
- 난소암세포에 과다발현하는 분자인 ErbB receptor를 표적하도록 아데노바이러스 외피단백질 fiber에 ErbB receptor에 대한 ligand인 heregulin으로부터 유래한 펩티드를 부착하였다. 53개의 아미노산으로 구성된 외부 펩티드를 fiber에 부착하였을 때 바이러스 감염에 중요한 기능을 하는 fiber 삼량체 구조 형성에 영향을 미치지 않았다. Fiber를 조작한 개량 아데노바이러스는 야생형 fiber를 가진 1세대 아데노바이러스 벡터에 비해 선택적으로 난소암으로 유전자를 전달하는 비율이 증가하였다.
- ErbB3 receptor의 발현이 현저히 증가되어 있는 유방암세포주 MCF7에서도 HβE-AdLac에 의한 유전자전달은 AdLac에 비해 증가하였으나 전체적인 유전자전달 효율은 떨어졌다(Fig. 4).
- 53개의 아미노산으로 구성된 외부 펩티드를 fiber에 부착하였을 때 바이러스 감염에 중요한 기능을 하는 fiber 삼량체 구조 형성에 영향을 미치지 않았다. Fiber를 조작한 개량 아데노바이러스는 야생형 fiber를 가진 1세대 아데노바이러스 벡터에 비해 선택적으로 난소암으로 유전자를 전달하는 비율이 증가하였다. 특히 항암제에 저항성을 가진 난소암세포주 OVCAR3에서 유전자전달 효율이 약 5배 증가되었다.
- 같은 양의 바이러스를 세포에 감염시켰을 때 HβEAdLac은 유방암세포주 MCF7이나 뇌종양세포주 LN319에 비해 난소암세포주인 OVCAR3와 SKOV3로 유전자를 더 효율적으로 전달하는 것을 확인하였다.
- 그러나 난소암세포주인 OVCAR3와 SKOV3에서는 HβE-AdLac이 야생형 fiber를 가진 AdLac에 비해 유전자를 훨씬 잘 전달하는 것을 알 수 있었다.
- 다른 세포주에 비해 난소암세포주인 OVCAR3와 SKOV3에서 ErbB2 발현이 현저히 높은 것을 알 수 있었고 이런 표적분자의 과다발현이 HβE-AdLac에 의한 유전자를 전달 효율 증가의 원인이 되는 것으로 추측된다.
- 비환원조건에서 수행한 Western Blot 분석에서 HβE-AdLac은 야생형 fiber와 마찬가지로 trimer 구조를 형성하는 것을 알 수 있었다.
- 유방암세포주인 MCF7과 뇌종양세포주인 LN319에서 HβE-AdLac에 의한 β-galactosidase 유전자전달이 AdLac에 비해 약간 증가하였으나 또 다른 뇌종양 세포주 U373MG에서는 큰 차이를 확인할 수 없었다.
- 이번 연구에서는 난소암세포에 과다 발현되는 것으로 알려진 ErbB2, ErbB3 receptor를 목표로 하여 이와 결합할 수 있는 최소 부위인 EGF domain 중 53개 아미노산으로 구성된 암세포 표적 ligand를 바이러스 외피에 부착한 재조합 아데노바이러스 벡터를 개발하였다. 이 벡터를 이용할 때 난소암세포주로 외래 유전자를 선택적이고 효율적으로 전달할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서 이번 연구에서 개발된 아데노바이러스에 살상 유전자 발현하도록 조작하면 난소암을 선택적으로 죽임으로써 효율적인 난소암 치료효과를 기대할 수 있는 바이러스 벡터를 개발을 할 수 있을 것으로 생각된다.
- Fiber를 조작한 개량 아데노바이러스는 야생형 fiber를 가진 1세대 아데노바이러스 벡터에 비해 선택적으로 난소암으로 유전자를 전달하는 비율이 증가하였다. 특히 항암제에 저항성을 가진 난소암세포주 OVCAR3에서 유전자전달 효율이 약 5배 증가되었다. 따라서 난소암의 유전자치료에서 개량된 아데노바이러스로 치료 유전자를 전달하면 치료의 효율성을 향상시킬 수 있을 것이다.
- 환원조건에서 수행한 Western Blot 분석에서 HβE-AdLac의 fiber는 AdLac의 야생형 Fiber보다 크기가 크게 나타났다.
후속연구
- 특히 항암제에 저항성을 가진 난소암세포주 OVCAR3에서 유전자전달 효율이 약 5배 증가되었다. 따라서 난소암의 유전자치료에서 개량된 아데노바이러스로 치료 유전자를 전달하면 치료의 효율성을 향상시킬 수 있을 것이다.
- 이 벡터를 이용할 때 난소암세포주로 외래 유전자를 선택적이고 효율적으로 전달할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서 이번 연구에서 개발된 아데노바이러스에 살상 유전자 발현하도록 조작하면 난소암을 선택적으로 죽임으로써 효율적인 난소암 치료효과를 기대할 수 있는 바이러스 벡터를 개발을 할 수 있을 것으로 생각된다.
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