Solid Phase Microextraction 및 Purge & Trap을 이용한 생물시료 중 휘발성 유기화합물의 GC/MS 분석비교 Comparison Solid Phase Microextraction with Purge & Trap on the GC/MS Analysis of Volatile Organic Compounds in Biota Samples원문보기
생물시료에 존재하는 휘발성 유기화합물 중 n-butylbenzene과 1,2-dibromo-3-chloropropane (DBCP)를 기체크로마토그래피/질량분석기-선택이온검색법에 의해 수행하였다. 시료 중 휘발성 유기화합물은 $100{\mu}m$ polydimethyl siloxane (PDMS) fiber를 사용하여 headspace solid phase microextractio (SPME) 및 purge & trap 방법에 의해 추출 및 비교하였다. SPME에 의한 회수율은 n-butylbenzene의 경우 85.8%, DBCP의 경우 92.4%로 나타났고 검출한계는 각각 $0.15{\mu}g/kg$, $0.05{\mu}g/kg$로 나타났다. 반면, purge & trap의 경우 회수율은 n-butylbenzene의 경우 115.2%, DBCP의 경우는 80.9%로 나타났고 검출한계는 각각 $0.04{\mu}g/kg$ 및 $0.70{\mu}g/kg$로 나타나 두 방법에 있어 국내에서 규제하는 검출한계측면에서 큰 차이는 없었다.
생물시료에 존재하는 휘발성 유기화합물 중 n-butylbenzene과 1,2-dibromo-3-chloropropane (DBCP)를 기체크로마토그래피/질량분석기-선택이온검색법에 의해 수행하였다. 시료 중 휘발성 유기화합물은 $100{\mu}m$ polydimethyl siloxane (PDMS) fiber를 사용하여 headspace solid phase microextractio (SPME) 및 purge & trap 방법에 의해 추출 및 비교하였다. SPME에 의한 회수율은 n-butylbenzene의 경우 85.8%, DBCP의 경우 92.4%로 나타났고 검출한계는 각각 $0.15{\mu}g/kg$, $0.05{\mu}g/kg$로 나타났다. 반면, purge & trap의 경우 회수율은 n-butylbenzene의 경우 115.2%, DBCP의 경우는 80.9%로 나타났고 검출한계는 각각 $0.04{\mu}g/kg$ 및 $0.70{\mu}g/kg$로 나타나 두 방법에 있어 국내에서 규제하는 검출한계측면에서 큰 차이는 없었다.
The analysis of n-butylbenzene and 1,2-dibromo-3-chloropropane (DBCP) as volatile organic compounds in biota samples was performed by gas chromatography/mass spectrometry-selected ion monitoring mode. The target compounds, n-butylbenzene and DBCP, in biota samples were extracted by headspace solid p...
The analysis of n-butylbenzene and 1,2-dibromo-3-chloropropane (DBCP) as volatile organic compounds in biota samples was performed by gas chromatography/mass spectrometry-selected ion monitoring mode. The target compounds, n-butylbenzene and DBCP, in biota samples were extracted by headspace solid phase microextraction (SPME) with $100{\mu}m$ polydimethyl siloxane (PDMS) fiber and purge & trap method. The extraction recoveries of these compounds obtained by SPME was 85.8% for n-butylbenzene and 92.4% for DBCP, respectively. Each value of method detection limit were $0.15{\mu}g/kg$ and $0.05{\mu}g/kg$, respectively. While in the case of purge & trap method, the extraction recovery was 115.2% for n-butylbenzene, 80.9% for DBCP and method detection limit were $0.04{\mu}g/kg$ and $0.70{\mu}g/kg$, respectively. The extraction yields and detection limits of these compounds obtained by purge & trap were equivalent to those by SPME.
The analysis of n-butylbenzene and 1,2-dibromo-3-chloropropane (DBCP) as volatile organic compounds in biota samples was performed by gas chromatography/mass spectrometry-selected ion monitoring mode. The target compounds, n-butylbenzene and DBCP, in biota samples were extracted by headspace solid phase microextraction (SPME) with $100{\mu}m$ polydimethyl siloxane (PDMS) fiber and purge & trap method. The extraction recoveries of these compounds obtained by SPME was 85.8% for n-butylbenzene and 92.4% for DBCP, respectively. Each value of method detection limit were $0.15{\mu}g/kg$ and $0.05{\mu}g/kg$, respectively. While in the case of purge & trap method, the extraction recovery was 115.2% for n-butylbenzene, 80.9% for DBCP and method detection limit were $0.04{\mu}g/kg$ and $0.70{\mu}g/kg$, respectively. The extraction yields and detection limits of these compounds obtained by purge & trap were equivalent to those by SPME.
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가설 설정
또한 분석에 있어서 GC에서 다른 휘발성 유기화합물과 겹치지 않아야 하며, 질량분석기에서 특성이온을 잘 나타낼 수 있어야 한다. 본 연구에서도 이러한 요구에 맞는 물질로 4-bromofluorobenzene을 내부 표준 물질로 정하였다. n-butylbenzene과 DBCP의 정량 분석 을 위한 표준검정 곡선 작성은 O.
제안 방법
각 화합물의 표준용액은 혼합표준용액으로 1000μg/ml의 농도를 025μg/ml-250ug/ml로 희석하여 5개의 검정용 표준혼합물을 만들고 내부 표준용액은 1000μg/ml의 농도를 10μg/ml이 되도록 메탄올을 사용하여 희석하여 제조하였다. 5개의 혼합한 표준용액에 내부 표준물질 4-bromofluorobenzene 1ul를 첨가한 후 GC/MS-SIM로 분석하여 시료별 검정 곡선을 얻었다.
본 연구에서도 이러한 요구에 맞는 물질로 4-bromofluorobenzene을 내부 표준 물질로 정하였다. n-butylbenzene과 DBCP의 정량 분석 을 위한 표준검정 곡선 작성은 O.25ng - 250ng 범위에서 5개 값을 선정하여 GC/MS-SIM로 분석하여 각 화합물의 이온크로마토그램에서 나타난 피크와 내부표준 물질 인 4-bromofluotobenzene피크의 면적비를 구하여 선형 회귀 곡선을 얻고 검정 곡선의 비교를 위하여 SPME 및 purge & trap 방식에 의해 작성된 직선식을 Table. 4에 실었다.
일반적으로 fiber?)- 오염되면 유기용매로 세척하거나 열처리를 할 수 있는데 액체상으로 코팅된 PDMS fiber는 유기용매에 의해 망가질 수 있으므로 열처리를 실시하였다 또한 fiber의 상태를 자주 점검하여 세척으로도 오염물을 완전히 제거할 수 없다면 교체해주어 야 한다. 검출한계값을 구하는 과정은 n-butylbenzene의 경우 바탕 실험에서 검출된 관계로 전체조작 바탕시험을 시행하였고, DBCP의 경우 IQng을 생체시료 10g에 첨가하는 첨가회수 실험을 7회 시행하였다. 이렇게 해서 구한 평균 회수율과 검출 한계를 Table 5에 실었다.
본 실험에서 SPME 및 purge & trap을 이용하여 분석대상물질에 대한 total ion chromatogram을 Fig. 1에 실었다. Fig.
또한 SPME방법의 경우 fiber를 통해서 오염되어질 수 있기 때문에 fiber 를 처음 사용할 경우 선택되어진 fiber의 종류에 따라 적합한 활성화 조건을 만들어 주어야 한다. 본 실험에서 사용한 PDMS fiber는 250ºC에서 1시간 동안 가열해 사용하였고 매번 분석이 완료된 후 열처리를 실시하였다. 일반적으로 fiber?)- 오염되면 유기용매로 세척하거나 열처리를 할 수 있는데 액체상으로 코팅된 PDMS fiber는 유기용매에 의해 망가질 수 있으므로 열처리를 실시하였다 또한 fiber의 상태를 자주 점검하여 세척으로도 오염물을 완전히 제거할 수 없다면 교체해주어 야 한다.
따라서 purge 효율의 최적 조건을 잡기 위해서는 각 실험파라메터의 조합을 효율적으로 택하여야 한다. 본 실험에서도 purge 시간, 온도 및 dry purge 시간을 각각 10분, 35°C 및 2분으로 정하였다.
본 연구에서는 양서류 및 어류 내에 존재하는 휘발성 유기화합물 중 n-butylbenzene과 DBCP를 headspace- SPME 및 purge & trap방법으로 추출하여 기체 크로마 토그래피/질량분석기-선택이온 검색법으로 정성 및 정량 분석을 하고 두 방법 간의 주줄율 및 검출 한계를 비교 검토하였다.
대상 데이터
Purge & trap장치는 Hewlett Packard사의 HP 7695 모델을 사용하였으며, purge 기체로는 helium을 사용하였고, trap의 흡착제로는 Tenax TA를 사용하였다. SPME 장치는 Supelco사의 manual holder 와 100μm) polydimethyl siloxane (PDMS) fiber를 사용하였으며 주입구관 (injection port liner)5] 내경은 0.
Purge & trap장치는 Hewlett Packard사의 HP 7695 모델을 사용하였으며, purge 기체로는 helium을 사용하였고, trap의 흡착제로는 Tenax TA를 사용하였다. SPME 장치는 Supelco사의 manual holder 와 100μm) polydimethyl siloxane (PDMS) fiber를 사용하였으며 주입구관 (injection port liner)5] 내경은 0.75mm (Supelco)가 사용되어졌다. 두 방법 모두 분석 칼럼은 DB-5MS cross linked 5% phenylmethylsilicone fused silica capillary column (30m x 0.
75mm (Supelco)가 사용되어졌다. 두 방법 모두 분석 칼럼은 DB-5MS cross linked 5% phenylmethylsilicone fused silica capillary column (30m x 0.25mm x 0.25 pm)을 사용하였으며, 운반기체로는 헬륨을 사용하였다. 두 실험방법에 대한 기체 크로마토그래피 분석기기 조건을 Table.
본 연구에서 사용된 모든 용매는 I T. Baker사 (Hiillipsburg, NJ, USA) 의 잔류농약 분석용을 사용하였으며, 분석 대상인 표준물l, 2~dibranK>3~chloropr야)ane (D0CP) 및 n-butylbenzen, 내부 표준물질인 4-bromofluoru- benzene은 Supelco사 (Bellefonte, PA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
이론/모형
질량분석기는 Hewlett-Packard HP6890 gas chroma tography / HP5973 mass selective detector를 사용하였으며, MS 의 이온화 방식으로 전자충격 이온화 (electron impact)법을 사용하였고 이온화 에너지는 70 eV 이었으며, 이온화 전류는 300 uA, 이온원의 온도는 230°C로 하였다. 본 실험에서 감도를 높이기 위하여 선택이온검색법 (selected ion monitoring, SIM)을 사용하였으며, 사용된 이온으로는 DBCP의 경우, m/z 75와 157이온, n-butylbenzene의 경우 m/z 91 및 134 이 온, 그리고 내부 표준물질인 4-bromofluorobenzene의 경우 m/z 174이온을 선택하여 검색하였다.
질량분석기는 Hewlett-Packard HP6890 gas chroma tography / HP5973 mass selective detector를 사용하였으며, MS 의 이온화 방식으로 전자충격 이온화 (electron impact)법을 사용하였고 이온화 에너지는 70 eV 이었으며, 이온화 전류는 300 uA, 이온원의 온도는 230°C로 하였다. 본 실험에서 감도를 높이기 위하여 선택이온검색법 (selected ion monitoring, SIM)을 사용하였으며, 사용된 이온으로는 DBCP의 경우, m/z 75와 157이온, n-butylbenzene의 경우 m/z 91 및 134 이 온, 그리고 내부 표준물질인 4-bromofluorobenzene의 경우 m/z 174이온을 선택하여 검색하였다.
성능/효과
immersion방법은 분석하고자 하는 물질이 fibei에 더 빨리 확산되기 때문에 평형 속도가 빠른 반면 headspace방법은 fiber가 직접 sample에 닿지 않으므로 방해물에 의한 영향이 적고, fiber의 수명이 길어진다는 장점을 가지고 있다. 20,21) 본 실험에서도 immersion 방법보다는 headspace방법이 더 효과적 이 였고, 다수의 시료를 반복적인 방법으로 분석해야 할 경우 더 적합한 방법이 될 수 있었다.
Table. 2에서와 같이 같은 농도의 내부표준 물질 및 분석 대상물질 을 GC/MS-SIM방식으로 계산한 상대감 웅비 (relative response factor, RRI7)를 통해서 n-butylbezene이 DBCP에 비해 약 3.6배 높은 감응을 보여줌을 알 수 있었다.
Table. 3에서 보는 바와 같이 SPME를 이용할 경우 본 연구에서 수립한 분석 조건으로 각 표준물질들은 12분 내에 잘 분리되었고 purge & trap의 경우보다 더 빠르게 분석될 수 있었다.
Table. 4에서 보듯 두 방법에 의해 작성된 n-butylbenzene과 DBCP의 검정 곡선은 모두 상관계수가 0.99 이상의 높은 직선성을 나타내었다.
1에 실었다. Fig. 1에서 보듯이, 내부 표준물질인 4-bromo- fluorobenzene과 분석물질인 n-butylbenzene 및 DBCP가 잘 분리되 었으며 크로마토그램상에서 n-butylbenzene이 DBCP에 비하여 높은 감도를 나타내었다. Table.
SPME과정에서 시료의 교반은 fiber 흡착제와 휘발성 물질간의 평형을 빠른 시간 내에 도달시킬 수 있는 장점이 있어 시료추출 시간을 단축할 수 있었고, 또한 휘발성 물질의 확산 속도를 증가시킬 수 있는 장점이 있다. 사용되는 시료의 양도검출한계를 낮출 수 있는 요인이지만 SPME의 경우 적은 양의 시료로도 이들의 검출이 가능한 장점을 가지고 있다
5에 실었다. SPME를 이용한 n-butylbenzene과 DBCP의 평균 회수율 은 각각 85.8%, 92.4%이었고 상대 표준편차는 9.6%와 5.3%이었다. purge & trap의 경우 평균 회수율은 n-butylbenzene의 경우 115.
검출한계 (method detection limit, MDL)값을 구하기 위하여 바탕 실험 (blank test)을 하였는데 7회 실시한 결과 n-butylbenzene의 경우 0.15/zg/kg이 검출되었다. 이는 purge & trap에 있어서 purgeable 부품에서 오는 것일 수 있는데 이를 피하기 위해서는 purge가 완료된 후 헬륨을 통한 역세척을 수행함과 동시에 trap을 가열해 줌으로서 trap된 오염물을 탈착시켜야 하고 또한 고농도 시료인 경우 희석을 통하여 purge & trap 장치의 오염을 막아야 한다.
70ug/kg kg이었다. 두 방법에 있어서 실험결과 값은 큰 차이가 없으나 SPME 분석 방법을 이용할 경우 시료를 소비하는 용매 없이 더 빠르게 분석할 수 있으며 추출과 농축을 한꺼번에 수행하므로서 생물시료뿐 아니라 다양한 매질로부터 휘발성이 강한 유기화합물의 분석을 용이하게 수행할 수 있다. 위의 방법은 어류, 쇠고기 시료 외에 지방 성분을 함유하는 식품, 돼지고기 등에 존재할 수 있는 다른 휘발성분의 분석에도 적용할 수 있을 것이다.
생물시료에 극미량으로 존재하는 휘발성 유기물질의 분석 방법에서 headspace~SPME 방법으로 n-butylbenzse과 DBCP의 평균 회수율 85.8%, 924%를 얻을 수 있었으며 각각의 상 대표준편차는 9.6%와 5.3%이었다. 또한 검출 한계의 경우는 n-butylbenzene이 0.
5%이었다 두 방법 모두 일본 후생성과 미국 EPA에서 제시하는 회수율 규제 수준 이내의 결과를 얻었다. 이 처럼 두 방법의 회수율에 대하여 약간의 차이는 있으나 재현성에 있어서 SPME방법이 좀 더 우수한 것으로 나타났다.
후속연구
두 방법에 있어서 실험결과 값은 큰 차이가 없으나 SPME 분석 방법을 이용할 경우 시료를 소비하는 용매 없이 더 빠르게 분석할 수 있으며 추출과 농축을 한꺼번에 수행하므로서 생물시료뿐 아니라 다양한 매질로부터 휘발성이 강한 유기화합물의 분석을 용이하게 수행할 수 있다. 위의 방법은 어류, 쇠고기 시료 외에 지방 성분을 함유하는 식품, 돼지고기 등에 존재할 수 있는 다른 휘발성분의 분석에도 적용할 수 있을 것이다.
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