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문제 정의
- 퇴비의 탄소원인 톱밥 등은 cellulose, hemicellulose를 비롯하여 lignin 및 pectin과 같은 분해되기 어려운 물질로 되어 있으나 (Han, 1987), Bacillus subtilis 등과 같은 미생물들이 체외 분비효소인 CMCase, xylanase와 lactase 등을 분비하여 난분해성 물질을 분해하고 탄소원으로 이용한다. 본 연구는 부산물비료에서 부숙촉진 미생물을 선발하여 현장적용을 위한 미생물의 특성을 검토코자 수행하였다.
제안 방법
- agar 15 g)를 사용. 희석평판법으로 50P에서 24 시간 배양하여 1차적인 부숙촉진균을 순수분리하였다. 순수분리된 균주를 TY-CMC (trypton 5 g.
- 1987)을가지는 균중에서 환이 큰 것을 2차분리 하였으며.xylan 및 PGA를 각각 5 g 첨가한 TY-xylan 및 TY-PGA 배지를 사용하여 50P에서 24시간 배양하고 분해 환이 가장 강한 균을 최종분리하였다.
- 공시균주의 병원성 조사는 70% ethanol과 1% chlorax용액으로 표면 살균 후 멸균증류수로 수회 세척한 배추종자를 nutrient 액체배지를 사용하여 40'C에서 24시간 배양한 세균을 약 108 cells ml ' 정도 현탁한액에 30분간 침종하고 nutrient 고체 사면배지에 2립씩 넣어 30℃ 항온기에서 4~7일간 배양하여 검정하였다. 작물 생육에 미치는 영향은 오이를 공시작물로 하여 종이컵에 배양한 세균을 약 108 cells t 농도가 되도록 10 씩 접종하여 생육시험을 하여 생육이 가장 양호한 LYH201 균주를 야생균주로 사용하였다.
- t 접종하여 pH는 4~9 범위. 온도는 30-60℃ 범위에서 2일간 배양하여 특성을 조사하였다.
- 분리균의 섬유질 분해능력을 관찰한 후 조직을 자세히 관찰하기 위하여 톱밥에 108 cells -를 1 ml 접종하고 7일 이후에 시료를 채취하여 주사전자현미경 (Hitachi. 모델 DST300)으로 2,000배의 배율로 관찰하였다. 주사전자현미경 (SEM) 관찰을 위한 톱밥조직의 표본조제 과정은 그림 .
대상 데이터
- 가축분 및 음식물 퇴비 132점에서 517균주를 분리하고 CMC와 xylan 및 PGA 배지에서 강한 활성을 가지는 10여개의 균주를 선별하여 배추종자 발아를 이용한 작물 inhibition test와 오이 육묘실험으로 growth test를 거쳐 생육이 가장 양호한 LYH201 균주를 야생 균주로 선발하였다. Bergey's manual 방법으로 특성을 조사한 결과 LYH201 균주는 Gram 양성균으로 내생포자 형성 , oxidase, CMCase, xylanase, catalase, V~P test, methyl red test, arabinose 등의 탄 소원 이용성은 양성이었으며, indole을 생성하고, urease, lecithinase, dihydrolase test는 음성이었고, 전자현미경으로 관찰한 결과 길이가 2.
- 가축분 및 음식물 퇴비 132점을 경남일원에서 수집하여 nutrient 고체 배지 (beef extract 3 g. peptone 5 g. agar 15 g)를 사용. 희석평판법으로 50P에서 24 시간 배양하여 1차적인 부숙촉진균을 순수분리하였다.
- 작물 생육에 미치는 영향은 오이를 공시작물로 하여 종이컵에 배양한 세균을 약 108 cells t 농도가 되도록 10 씩 접종하여 생육시험을 하여 생육이 가장 양호한 LYH201 균주를 야생균주로 사용하였다.
이론/모형
- 분리균의 세균학적, 형태학적. 배양학적, 생화학적 성질은 Bergey's manual의 방법 (Holt, 1984)에 준하였다. 분리균의 동정은 세포벽 고유 지방산 함량에 따른 MIDI system으로 동정하였다.
- 7. Detection of cellulase, α-amylase and protease after 24 hrs incubation at different temperature by agar diffusion method(A, E. coli for negative control; B, Bacillus subtilis LYH201).
성능/효과
- LYH201 균주는 Gram 염색 결과 양성으로 나타났으며 전자현미경 관찰을 하여 본 결과 그림 2와 같이 길이가 2.5~3.0 ㎛, 너비가 0.5~0.7 의 간균이었다. Bergey's manual에 의하여 동정한 결과 LYH201 균주는 표 1과 같이 내생포자를 형성하고, oxidase,CMCase, xylanase, catalase, V-P test, methyl red test는 양성이었으며 indole을 생성하고 urease,lecithinase, dihydrolase test는 음성이었고 arabinose 등의 탄소원 이용성은 양성으로 나타났다.
- 7 의 간균이었다. Bergey's manual에 의하여 동정한 결과 LYH201 균주는 표 1과 같이 내생포자를 형성하고, oxidase,CMCase, xylanase, catalase, V-P test, methyl red test는 양성이었으며 indole을 생성하고 urease,lecithinase, dihydrolase test는 음성이었고 arabinose 등의 탄소원 이용성은 양성으로 나타났다.
- 분리된 LYH201 균주를 MIDI system으로 세포벽 고유 지방산을 분석한 결과는 그림 3과와 같으며, database에서 분석한 결과 Bergey's manual과 같은 Bacillus subtilis로 확인되었다.
- LYH201 균주의 탄소원별 균생육상황은 표 2와 같이 saccharose에서 생육이 가장 왕성한 반면 fructose에서 낮았다
- 4와 같이 50℃로 나타났다. LYH201 균주를 MMY 를 이용하여 pH와 온도별 균 생육특성은 그림 5와 같이 온도는 50P, pH는 6.0에서 생육이 가장 빠른 것으로 나타났다
- 한천 확산법 에 의하여 50℃에서 LYH201 균주를 24 시간 배양한 후 섬유질 분해효소 생성을 시험한 결과 그림 6과 같이 CMCase와 xylanase 활성을 나타내는 환을 생성하였으며 타 균주에 비하여 그 활성이 매우 강하였다. 한천 확산법에 의하여 확인되는 효소활성 측정은 앞으로 이들 효소의 유전자를 클로닝하여 분리, 확인하는데 유용한 방법이라고 생각된다.
- LYH201 균주를 30℃와 5CTC의 다른 온도조건에서 24시간 배 양한후 효소활성을 측정한 결과 그림 7과 같이 CMCase, α-amylase 및 protease 활성은 30℃보다 50P에서 활성이 큰 것으로 나타났다. 따라서 LYH201 균주는 고온에서 생육뿐만 아니라 분해효소의 분비도 왕성하다는 것을 알 수 있었으며 퇴비화 과정 시 분해미생물로서 이용가능성이 클 것으로 판단되었다.
- 따라서 LYH201 균주는 고온에서 생육뿐만 아니라 분해효소의 분비도 왕성하다는 것을 알 수 있었으며 퇴비화 과정 시 분해미생물로서 이용가능성이 클 것으로 판단되었다.
- 9와 같다. 정상 톱밥 조직은 손상이나 와해가 적은조직이었으나 LYH201 균주를 접종한 조직은 3, 000배에서 관찰한 것으로 대조구에 비하여 LYH201 균주에 의하여 많이 와해되고 조직이 손상된 것을 알 수 있었다.
- 선발하였다. Bergey's manual 방법으로 특성을 조사한 결과 LYH201 균주는 Gram 양성균으로 내생포자 형성 , oxidase, CMCase, xylanase, catalase, V~P test, methyl red test, arabinose 등의 탄 소원 이용성은 양성이었으며, indole을 생성하고, urease, lecithinase, dihydrolase test는 음성이었고, 전자현미경으로 관찰한 결과 길이가 2.5~3.0 ㎛, 너비가 0.5 ~0.7 ㎛의 간균인 Bacillus subtilis로 확인되었.다.
- 다. Bacillus subtilis LYH201 균주를 MMY를 이용하여 배양한 결과 온도 50 ℃, pH 6.0에서 생육이 가장 좋았다.
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