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문제 정의
- 본 연구에서는 capsaicin으로 통증을 유발시킨 후각신경활성의 지표로 이용되는 원종양유전자인 c-fos의 변화로 경피신경전기자극의 효과를 척수 천층에서 형태학적으로 관찰, 분석하고자 한다. 이를 위해서 흰쥐를 실험동물로 사용하여 capsaicin으로 통증모델을 만든 후 (1)척수 등쪽뿔에서 통증에 대한 반응을 나타내는 c-fos 단백질의 변화를 면역조직화학적 방법으로 염색한 후 그 변화를 정량화하였고, (2)저빈도 경피신경전기자극과 고빈도 경피신경전기자극을 각각 적용한 c-fos 단백질의 변화를 정 량화하였다.
제안 방법
- 물은 수돗물을 사용하였으며 사료는 삼양유지사료주식회사에서 생산한 실험동물(쥐)용 사료를 물과 함께 자유급식하였다. 사육실 온도는 23±2t?, 습도는 50±2%로 최적의 상태를 유지하였고, 사육장의 광주기를 오전 8시부터 오후 10까지로 조절하였으며 그 나머지 10시간은 암주기로 조절하였다.
- 03%(60μl/200μl)로 처리하였다. 0.01M phosphate bufIer(10분, 3회)에 수세하고 증류수 (10분, 3회)에 수세하였다. 그리고 곧바로 샤알레에 0.
- 24시간 동안 보관된 1차 항체 속 조직을 0.01M PB(phosphate buffer)로 10분씩 3회 수세한 후 다시 2차로 streptavidine과 0.03% Triton X-100, 0.2% normal goat serum에 조직을 담구어 실온에서 90분 동안 처리하였다. 이 조직을 다시 0.
- Capsaicin(8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide :sigma)을 용매 (10% ethanol, 10% Tween-80, 80%생리식염수)에 용해시켜 50㎎/㎏ 농도로 좌골신경이 지나는 슬괵근에 1회 피하주사(피하조직)하였다. 경피신경전기자극은 사지와 몸통을 자체 제작한 실험대에 고정 하여 적용하였다.
- Capsaicin으로 12마리의 웅성 흰쥐에게 통증을 유발 시킨 모델에서 저빈도(4Hz, 200㎲, 20분) 경피신경전기 자극과 고빈도(100Hz 50㎲, 20분) 경피신경전기자극의 효과를 정량적으로 알아보기 위하여 cTbs를 이용하여 면역조직화학법을 실시한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 1.
- 경 피신경전기자극 (TENS 120Z, ITO CO.LTD, Japan)은 고빈도(100Hz, 5(㎲, 20분)와 저빈도(4Hz, 200㎲, 20분)를 최소강도 lmA로 적용하였다. 전극 패드중 하나를 대퇴 슬괵근의 중앙부에 접지하고, 다른 하나는 요추부에 적용하였다.
- Capsaicin(8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide :sigma)을 용매 (10% ethanol, 10% Tween-80, 80%생리식염수)에 용해시켜 50㎎/㎏ 농도로 좌골신경이 지나는 슬괵근에 1회 피하주사(피하조직)하였다. 경피신경전기자극은 사지와 몸통을 자체 제작한 실험대에 고정 하여 적용하였다.
- 01M phosphate buffer(10분, 3회)로 또 다시 수세하였다. 다음 증류수 200지에 소량의 DAB(3'5-diaminobenzidine)를 5분간 완전 용해시켜 다시 여과하여 이 용액에 조직을 10분간 처리하였고 이후 Wasserstoffperoxid 30% H2O2(Perhydrol)를 0.03%(60μl/200μl)로 처리하였다. 0.
- 생후 6주된 웅성 Sprague-Dawley계 흰쥐(체중200-250g) 12마리를 무작위로 사용하였다. 대조군 8마리, 1차 실험군인 고빈도 경피신경전기자극 (100Hz, 50㎲)군 2마리, 2차 실험군인 저빈도 경피신경전기자극 (4Hz, 200㎲)군 2마리로 나누어 사용하였다. 물은 수돗물을 사용하였으며 사료는 삼양유지사료주식회사에서 생산한 실험동물(쥐)용 사료를 물과 함께 자유급식하였다.
- 면역조직화학 처리과정을 거친 절편들은 반응을 나타낸 세포 수를 검사하기 위해 영상 분석을 실시하여 bfos 를 x40 자료로 분석하였으며, 척수 천층(Laminae I and II)에 반응을 나타낸 수를 세었다.
- 본 논문에서도 capsaicin으로 증을 유발시 킨 천층인 라미나 I ,H 에서 c-fos 단백질양^ 신경원의 수가 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 척수 천증은 특히 A$와。섬유가 주로 종지하고, 몰핀이 활성화하는 주요부위이기 때문에(Abbadie 등, 1994) 본 연구에서 선택하여 집중적으로 관찰하였다. c-fos는 주로 척수의 통증전달 신경원에서 발현되고 일차신경원인 척수신경절 신경원에서는 나타나지 않으며 기타 뇌에서 통증에 관계된 부위에도 발현된다(박경아 등, 1997： Hu 등, 1993： Jones & Light, 1990： Tavares 등, 1993).
- 본 연구에서는 capsaicin으로 통증을 유발시킨 후각신경활성의 지표로 이용되는 원종양유전자인 c-fos의 변화로 경피신경전기자극의 효과를 척수 천층에서 형태학적으로 관찰, 분석하고자 한다. 이를 위해서 흰쥐를 실험동물로 사용하여 capsaicin으로 통증모델을 만든 후 (1)척수 등쪽뿔에서 통증에 대한 반응을 나타내는 c-fos 단백질의 변화를 면역조직화학적 방법으로 염색한 후 그 변화를 정량화하였고, (2)저빈도 경피신경전기자극과 고빈도 경피신경전기자극을 각각 적용한 c-fos 단백질의 변화를 정 량화하였다.
- 01M phosphate buffer를 넣고 조직을 펴서 슬라이드에 올렸다. 이후 cresyl violet acetate와 toluidin blue를 이용하여 3분간 대조염색 (counterstaining)을실시하였으며, 흐르는 물에 5분간 수세하고 탈수과정 (50%-70%-80%-90%-95%-100% ethanol-100% xylene 1-100% xylene II)을 각각 10분씩 거친 다음 광학현미경적 관찰을 위한 영구 보존 방법으로 PMM(perment mounting media)을 이용하여 cover glass로 봉입하였다.
- 패드는 적용부위를 삭모한후 밴드로 고정시켜 적용하였다. 조직은 경피신경전기자극 적용 20분 경과후 1시간이 지난 다음 전신 마취제인 럼푼(Rompun, 바이엘코리아)을 복강주사(0.4ml)하여횐쥐를 마취하여 심장관류(0.9% Nacl)와 조직 전고정 (8% paraformaldehyde, pH 7.2-7.4)을 실시하고 척수 중 요수 부분을 체취하여 면역조직화학검사를 위해두시간 동안 후고정 (8% paraformaldehyde)하여 수크로즈 (25% sucrose)에 하루 동안 보관하였다. 대조군은 위와 같은 실험 방법을 적용하였으나 경피신경전기자극의 직접적인 적용은 하지 않았다.
- 형태학적 관찰에는 광학현미경 (Olympus Bx 50, Japan)을 이용하였고, 현미경에 장착된 CCD 카메라 (Toshiba, Japan)와 개인용 컴퓨터를 연결시켜 자료전송을 실시하였으며 , 디지털 영상화된 자료는 Image-pro plus ver 4.0 for windows(Media cybernetics, USA)를 이용하여 촬영 및 영상분석(image analysis)을 시행 하였다.
- 후고정이 끝난 조직은 극저온 냉동기를 이용하여 영하 35℃ 이하로 냉동하였고 이 냉동된 척수의 요수부위를 미세절단기(microtome, BRIGHT 5040)를 사용하여 25㎛ 두께로 잘라 0.01M phosphate buffer(PB)에 처리하고 그 조직을 1차 항체 (rabbit) c-fos (희석률 200% Anti-c-Fos : sigma) 500μl에 처리하여 24시간 동안 냉장보관하였다.
대상 데이터
- 대조군 8마리, 1차 실험군인 고빈도 경피신경전기자극 (100Hz, 50㎲)군 2마리, 2차 실험군인 저빈도 경피신경전기자극 (4Hz, 200㎲)군 2마리로 나누어 사용하였다. 물은 수돗물을 사용하였으며 사료는 삼양유지사료주식회사에서 생산한 실험동물(쥐)용 사료를 물과 함께 자유급식하였다. 사육실 온도는 23±2t?, 습도는 50±2%로 최적의 상태를 유지하였고, 사육장의 광주기를 오전 8시부터 오후 10까지로 조절하였으며 그 나머지 10시간은 암주기로 조절하였다.
- 생후 6주된 웅성 Sprague-Dawley계 흰쥐(체중200-250g) 12마리를 무작위로 사용하였다. 대조군 8마리, 1차 실험군인 고빈도 경피신경전기자극 (100Hz, 50㎲)군 2마리, 2차 실험군인 저빈도 경피신경전기자극 (4Hz, 200㎲)군 2마리로 나누어 사용하였다.
데이터처리
- 둘째, 면역조직화학적 소견의 통계처리는 요수부위의 절편 조직에 발현된(rfos의 수를 통계 프로그램인 MS office 2000 Excel을 이용하여 일원배치분산분석으로 처리하였다. 유의수준은 p< .
성능/효과
- 2. Capsaicin 투여 2시간 후 저빈도(4Hz, 200ms, 20분), 고빈도(100Hz, 50g 20분의 경피신경전기자극을 적용하여 척수 등쪽뿔의 천충에서 c-fos 양^ 신경원의 수가 유의하게 감소하였다.
- 3. Capsaicin 투여 2시간 후의 급성 통증모델에서 저 빈도와 고빈도 경피신경전기자극을 적용한 결과 저빈도의 경피신경전기자극이 고빈도에 비해 c-fos 세포수를 더욱 유의하게 감소시켰다.
- 1. Capsaicin 투여 2시간 척수 등쪽뿔내 천층에서 c-fos의 발현이 최고였으며, 시간 후에는 2시간에 비해그 수가 감소되었고 8시간 후에는 현저하게 감소되었고, 16시간 후에는 극소수의 c-fos 발현만 관찰할 수 있었다.
- Capsaicin 투여 2시간 후 최고로 발현된 c~fos에 경피신경전기자극 적용 결과 저빈도군과 고빈도군 둘다 유의하게 c-fos 단백질에 양성을 나타내는 세포수의 감소를 보였다. 더욱이 저빈도군에서 c-fos 발현의 감소가 현저하였다(Table.
- Capsaicin 투여후 c-fos 단백질에 양성을 나타내는 세포의 수가 최고로 발현된 2시간에 저빈도(4Hz, 200㎲) 경피신경전기자극 적용후 세포의 수는 26.5개로 감소되 었고, 고빈도(100Hz, 50㎲) 경피신경전기자극 적용후 세포 수도 33.33개로 감소되었다(Fig 2, Fig 5, Table 4). 이들 각 집단의 평균에도 유의한 차이가 있었다(p〈 .
- 척수 등쪽뿔 천층(Laminae I and ID에서 c-fos 단백질을 항원으로 하는 면역조직화학적 방법으로 염색한 표본에서 c-fos 면역반응 세포들은 작고 어두운 둥근 모양으로 나타났다. capsaicin 투여 2시간 후 c-fos 단백질에 양성을 나타내는 세포의 수는 평균 89.33개로 나타났으며, 4시간 후의 면역반응 양성 신경원의 수는 평균 24.33개로 감소했으며, 8시간 후의 양성 신경원의 수는 14.67개로 나타났고, 16시간 후의 신경원 수는 3.17개로 소수만 나타났다(Fig 1. Fig 4, Table 3). 이들 각 집단의 평균에는 유의한 차이가 있었다(p〈 .
- 저빈도 경피신경전기자극이 휠씬 c-fos 발현을 감소시 킨 것은 급성통증모델에서 고 빈도에 비해 저빈도의 경피신경전기자극이 더욱 효과적임을 알 수 있었다. 또한 본 연구를 통해 경피신경전기자극이 통증모델에서 미치는 효과를 정량적으로 관찰할 수 있어, 전기치료에 대한 과학적인 근거를 마련할 수 있었다.
- 여러 연구들은 유해자극을 가한후 c-fos가 라미나 I, II와 V, X에서 발현한다고 하였다 (Besson & Chaouch, 1987； Bullitt, 1990； Hams, 1998, Gogas, 1991). 본 논문에서도 capsaicin으로 증을 유발시 킨 천층인 라미나 I ,H 에서 c-fos 단백질양^ 신경원의 수가 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 척수 천증은 특히 A$와。섬유가 주로 종지하고, 몰핀이 활성화하는 주요부위이기 때문에(Abbadie 등, 1994) 본 연구에서 선택하여 집중적으로 관찰하였다.
- 본 연구에서도 다른 빈도의 경피신경전기자극이 capsaicin으로 유발된 erfos의 발현을 등쪽뿔 내에서 감소시켜, 경피신경전기자극이 척수 수준에서 부분적으로 유해자극 전달을 억제시키는 효과가 있음을 증명하였다. 더욱이 저빈도 경피신경자극이 크게 c-fos 발현을 감소 시킨 것은 Lee와 Beitz(1992)의 연구와 일치하였다.
- 이상의 결과로 볼 때, Capsaicin으로 통증을 유발후 급격한 c-fos 발현의 증가에 경피신경전기자극의 적용이 b fos 발현을 감소시켜 경피신경전기자극이 통증 억제에 효과가 있음을 확인할 수 있었고. 저빈도 경피신경전기자극이 휠씬 c-fos 발현을 감소시 킨 것은 급성통증모델에서 고 빈도에 비해 저빈도의 경피신경전기자극이 더욱 효과적임을 알 수 있었다.
- 이상의 결과로 볼 때, Capsaicin으로 통증을 유발후 급격한 c-fos 발현의 증가에 경피신경전기자극의 적용이 b fos 발현을 감소시켜 경피신경전기자극이 통증 억제에 효과가 있음을 확인할 수 있었고. 저빈도 경피신경전기자극이 휠씬 c-fos 발현을 감소시 킨 것은 급성통증모델에서 고 빈도에 비해 저빈도의 경피신경전기자극이 더욱 효과적임을 알 수 있었다. 또한 본 연구를 통해 경피신경전기자극이 통증모델에서 미치는 효과를 정량적으로 관찰할 수 있어, 전기치료에 대한 과학적인 근거를 마련할 수 있었다.
- 척수 등쪽뿔 천층(Laminae I and ID에서 c-fos 단백질을 항원으로 하는 면역조직화학적 방법으로 염색한 표본에서 c-fos 면역반응 세포들은 작고 어두운 둥근 모양으로 나타났다. capsaicin 투여 2시간 후 c-fos 단백질에 양성을 나타내는 세포의 수는 평균 89.
- 척수 등쪽뿔 천층(Laminae I and II)에서 c-fos 단백질을 항원으로 하는 면역조직화학적 방법으로 염색한 표본에서 캡사이신 투여 2시간 c-fos 단백질에 양성을 나타내는 세포의 수가 최고로 나타났고, 4시간 후에는 감소하는 경향을 보이다가 8시간과 16시간 후에는 거의 나타나지 않았다(Table. 1).
- 첫째, 형태학적 소견에서 육안적 소견은 광학현미경 하에서 단위 면적 당 반응성을 기준으로 매우 높음을+ + + , 높음을 + + . 보통을 +.
후속연구
- 위에서 언급한 여러 연구들에 의해 c-fos의 발현과 Ca++ 관계는 필수적인 것으로 생각되고, 경피신경전기자극에 의한 c-fos 발현의 감소에 Ca+,와 오피움계가 관여 하는 것으로 사료된다. 오피움계에 대한 연구들은 많이 밝혀져있는데 비해 Ca++에 대해서는 앞으로 더 자세한 연구가 필요하다.
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