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문제 정의
- 그 중 가장 좋은 결과를 보인 유향(。此anum)26, 27)은감람나무과의 수간에서 얻은 수지성분으로 활혈, 지혈, 진통, 소염 등의 작용이 있는 것으로 알려져 있다 그러나 유향이 MC3T3-E1세포의 활성화 및 골 형성 능력에 영향을 미치는 지는 아직 많이 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 한국의 민간요법에 활용되고 있는 유향 추출물을 MC3T3-E1세포에 처리한후 세포활성 및 분화에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 세포증식 , 염기성 인산분해효소 활성도 측정을하고, 초기 골 광물화에 관여하는지 평가하기 위해시험관내 골형성능력측정을 시행하고, 비교원성 단백질에 의해 광물화가 일어날 수 있는 주형을 제공하며 골형성의 초기에 작용하는 교원성 단백질 중 type I collagen의 발현을 검색 하고자 한다.
- 수준에 이른 것들도 있다. 따라서 본 연구에서확인한 유향추출물의 조골세포에 대한 기능적 활성화, ALP생성의 증가, 골결절의 생성 및 type I colla- gen의 발현에 미치는 영향은 치주염에 의해 손상, 결손된 치주조직의 재생을 위한 약제로서의 응용가능성을 시사하는 것이 라고 하겠다.
제안 방법
- MC3T3-E1 세포를 6-well plate에 각 well당 1X105 개 씩 분주한 후 10% FBS, 1% 항생제, 50 經/ml ascorbic acid, 10 mM sodium μ-glycerophosphate기" 첨가된 a-MEM으로 2, 4일간 100% 습도, 5% CO2 공기 혼합배양기에서 배양하였다. 배지를 제거한 후, 실험군은 0.
- 5, 6회 계대 배양된 MC3T3-E1세포를 0.25% Trypsin/EDTA로 떼어내어 혈구계수기로 세포수를세어 24-well plate의 각 well당 1X104개의 세포가들어가도록 분주하였다. 세포들이 부착할 수 있도록 1일간 5% CO2, 100% 습도의 37℃ 배양기에서 배양한 후 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 배지를교환하고, 0.
- 300:1로 희석한 일차 항체를 처리한 후 R/T에서 1시간 동안 배양하고, 2차 항체를 처리 후 R/T에서 20분간 배양하였다. Substrate를 처리한 후 도립현미경으로 관찰 후 사진 촬영을 하였다.
- 1 經/ml의 dexamethasone을 음성대조군에는 증류수를 첨가하고, 2일마다 배지를 교환하면서 21일 동안 배양기에서 배양하였다 일정 배양시간이 지난 후 각 well의배지를 제거하였다. ice-cold PBS로 2번 세척하고, neutral buffered formalin(NBF)으로 4C 에서 48시간동안 고정한 후, NBF를 제거하고 PBS로 다시 2회 세척하고, 5% silver nitrate를 첨가하여 뚜껑을 열고 약 30분 동안 직사광선에 노출하여 석회화 결절을 염색하였다 Silver nitrate를 제거 후 5% sodium thiosulfate로 세척하고 현미경으로 관찰하였다.
- 골기질 단백을 만들어 내고 광화시킬 수 있는 생쥐 두개골의 MC3T3-E1(mouse cal.,arial osteoblasts) 세포를 10% fetal bovine serum(FBS, GibcoBRL, USA)과 1% 항생제(Penicillin G sodium 10, 000 units/ml, streptomycin sulfate 10, 000 燃/初 and Amphotericin B 25 仏g/ml in 0.85% saline, GibcoBRL, USA)가 첨가된 a- minimum essential medium(a-MEM, GibcoBRL, USA) 2 初가 담긴 6-well plate에 적정 세포(5X104 cells/well)를 분주하였다. 이를 37C 의 온도 및 100% 습도조건에서 95%의 공기와 5% CO2를 계속 공급하면서 배양하였다.
- USA) 용액 300 回씩을 각각의 well에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 200 回의 DMSO(dimethyl sulfoxide; Junsei, Japan)를 첨가하여 형성된 formazan 결정을용해시킨 후 세포활성도를 보기 위해 96-well plate 상으로 옮겨서 ELISA analyser(Spectra MAX 250, Molecular Devices Co., USA)로 540 nm에서 흡광도를측정하였다.
- 배양하였다. 배지를 제거한 후, 실험군은 0.1 經/ml, 1 經/ml, 10 經/ml의 유향 추출물을 배지와 함께 첨가하고, 양성대조군은 0.1 經/ml 의 dexamethasone을, 음성대조군에는 증류수를 첨가한 후 각각 2, 4일 동안 배 양하였다. 일정 배 양 시간이 지난 후 배지를 제거하고 trypsin/EDTA로 세포를 phate :Sigma, USA) 0.
- 본 연구에서 사용한 유향2當力은 감람나무과의 수간에서 얻은 수지성분으로 활혈, 지혈, 진통, 소염등의 작용이 있는 것으로 알려져 있어, 유향 추출물이치조골의 재생과 형성에 주된 작용을 하는 조골세포에 미치는 효과를 조사하기 위해서 조골모유사세포에 대한 MTT분석과 ALP를 측정하였고, 세포 수준에서 골결절 형성 능력을 측정하기 위해 Von kossa 염색하여 계측하였고, 골형성에 관여하는 세포외기질로 작용하는 collagen의 발현 영향을 알아보기 위해면역세포 화학적 분석으로 계측하였다 .
- 석회화 결절 형성에 대한유향 추출물의 영향을 알아보기 위하여 세포를 6-well plate에 1x 105cells/well가 되도록 분주한 후 50 經/ml ascorbic acid, 10 mM μ-glycerophosphate가 함유된 10% FBS 배지를사용하여 실험군에는 1 經/ml, 10 經/ml의 유향 추출물을 첨가하고, 양성대조군에는 0.1 經/ml의 dexamethasone을 음성대조군에는 증류수를 첨가하고, 2일마다 배지를 교환하면서 21일 동안 배양기에서 배양하였다 일정 배양시간이 지난 후 각 well의배지를 제거하였다. ice-cold PBS로 2번 세척하고, neutral buffered formalin(NBF)으로 4C 에서 48시간동안 고정한 후, NBF를 제거하고 PBS로 다시 2회 세척하고, 5% silver nitrate를 첨가하여 뚜껑을 열고 약 30분 동안 직사광선에 노출하여 석회화 결절을 염색하였다 Silver nitrate를 제거 후 5% sodium thiosulfate로 세척하고 현미경으로 관찰하였다.
- 25% Trypsin/EDTA로 떼어내어 혈구계수기로 세포수를세어 24-well plate의 각 well당 1X104개의 세포가들어가도록 분주하였다. 세포들이 부착할 수 있도록 1일간 5% CO2, 100% 습도의 37℃ 배양기에서 배양한 후 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 배지를교환하고, 0.1 經/ml, 1 經/ml, 10 經/ml의 유향 추출물을 첨가하고 2, 4일 동안 배양하였으며 , 대조군에는 증류수를 넣었다. 각각의 시간이 경과된 후 생리식 염수로 용해한 MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)- 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide ; No.
- 세포를 1X105개 씩 35 mm dish에 분주한 후 음성대조군에는 증류수를 양성대조군에는 0.1 經/ml의 dexamethasone을 두 실험군에는 각각 1 經/ml, 10 經/ml의 유향 추출물을 첨가하고 4일 동안 배양한다. 일정한 시간이 경과하면 type I collagen의 일차 항체를 희석하여 준비하고 4% paraformaldehyde 1 ml로 5분간 고정 한 후 100%, 90%, 80%, 70% ethanol 로 15-20초간 처리하였다.
- 1 經/ml의 dexamethasone을 두 실험군에는 각각 1 經/ml, 10 經/ml의 유향 추출물을 첨가하고 4일 동안 배양한다. 일정한 시간이 경과하면 type I collagen의 일차 항체를 희석하여 준비하고 4% paraformaldehyde 1 ml로 5분간 고정 한 후 100%, 90%, 80%, 70% ethanol 로 15-20초간 처리하였다. 1XPBS로 5분간 3회 걸쳐 세척한 후 3% H2O2로 10분간 처리하고 다시 1XPBS 로 5분간 3회에 걸쳐 세척하고 blocking올 시행하였다.
- 전통적으로 이용되어 온 생약제제 중 활혈, 지혈, 진통, 소염 등의 작용이 있는 유향이 조골세포 활성에 미치는 영향을 알아보고자, MC3T3-E1 세포를 이용하여 세포활성도 측정, 염기성 인산분해효소 활성도 측정과 시험관내 골형성 능력측정 및 광물화가 일어나는 부위 에서 주형으로 작용하는 type I colla- gen의 발현도를 평가하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 원광대학교 약학대학에 의뢰하여 유향 100 g을 분말형 태로 분쇄하여 증류수 11와 혼합하여 가열 여과한 후 1,500 rpm의 rotatory evaporator로 농축한다음 freeze dryer로 동결 건조하여 얻어진 분말을 이용하였다. 분말 1g을 증류수 10说에 섞어 stock solution올 만들어 농도별로 희석한 후 0.
데이터처리
- 유향의 실험군과 대조군 간의 차이 및 2일과 4일 사이의 차이를 알아보기 위하여 MTT값과 ALP값을 일원분산분석법(ANOVA)으로 실험결과에 유의성이 있는지 유의수준 0.05에서 통계학적으로 검증하였다.
성능/효과
- 1. MC3T3-E1 세포에 유향추출물을 투여하여 세포활성도을 측정한 결과 4일째의 1 經/ml군이 대조군보다 세포활성도가 높았다(p<0.05).
- 1 經/ml, 1 經/ml, 10 經/ml을 MC3T3-E1 세포에 투여하여, 골재형성과 재생이 일어나는 부위에서 국소적 인산이온 농도를 증가시키는 ALP의 합성을 측정한 계측치는 Table 2와 같다. 2 일째에는 실험군과 대조군간 유의한 차이는 없었으나, 1 經/ml군이 가장 높은 ALP합성을 보였고, 4일째에는 0.1 經/ml에서 1 經/ml으로 농도가 증가하면서 ALP합성이 증가하였으나 10 經/ml으로 농도가 증가시 ALP합성이 오히려 낮아졌으며, 1 經/ml군이 음성대조군과 비교시 통계적으로 유의한 군간 평균치 차이가 있는 것으로 나타났다(Table 2, Figure 2).
- 2. MC3T3-E1 세포에 유향추출물을 투여하여 염기성 인산분해효소의 활성을 측정한 실험에서 4 일째 1 經/ml 투여군이 음성대조군보다 염기성인산분해효소 활성이 높았다(p<0.05).
- 3. 세포수준에서 관찰한 골결절 형성의 Von kossa 염색 측정에서 각 측정치를 백분율로 환산한결과 1 經/ml 투여군이 가장 많은 염색을 보였다.
- 4. 골 형 성시 세포외 기질로 작용하는 collagen 발현을 보기 위한 면역세포화학 검사에서 10 經 /ml 투여군과 음성대조군이 적은 collagen 발현을 보였고, 양성대조군과 1 經/ml 투여군이 많은 collagen 발현을 보였으며 , 1 經/ml 투여 군이 가장 많은 collagen 발현을 보였다
- 05<p). 4일째에는 농도가 0.1 經/ml에서 1 經/ml으로 증가하면서 세포활성도가 높았으나, 농도가 10 經/ml로 증가하면서 세포활성도가 낮아 dexamethasone을 사용한 대조군보다 더 낮은 결과를 나타내었고, 1 經/ml군이 대조군에 비해 통계학적으로 유의성이 있는 결과를 나타내 었다(Table 1, Figure 1).
- MC3T3-E1세포에 대해 유향 추출물 0.1 經/ml, 1 經/ml, 10 經/ml과 대조군을 가지고 시행한 세포활성도의 실험 결과에서 2일째에는 1 經/ml군이 가장많은 세포활성도를 보였고, 군간의 통계학적 유의성은 없었다(0.05<p). 4일째에는 농도가 0.
- 이러한 교원성 단백질은 비교원성 단백질에 의해 광물화가 일어날 수 있는 주형을 제공하여 골형성의 초기에 작용하며, ALP와 같은 골기질은 조골모유사세포의 분화와 골기질의 성숙에 중요한 역할을 한다33). 골형성시 세포외 기질으로 작용하는 collagen의 발현을 보기 위하여 유향 추출물을 MC3T3-E1 세포에 투여하고 면역화학 검사를 시행하여 type I collagen 이 발현된 염색 면적을 각각의 전체 면적으로 나누어 백분율로 나타낸 결과, 10 經/ml군과 음성대조군이 적은 collagen 발현을 보였고, 양성대조군과 1 經/ml군이 많은 collagen 발현을 보였으며 , 1 經/ml군이 가장많은 collagen 발현을 보였다(Photo 2, Figure 4).
- 골형성시 세포외 기질으로 작용하는 collagen의 발현을 보기 위하여 유향 추출물을 MC3T3-E1 세포에 투여하고 면역화학 검사를 시행하여 type I collagene 발현된 염색 면적을 각각의 전체 면적으로 나누어 백분율로 나타낸 결과, 10 經/ml군과 음성대조군이 적은 collagen 발현을 보였고, 양성대조군과 1 經/ml군이 많은 collagen 발현을 보였으며, 1 經/ml군이 가장 많은 collagen 발현을 보였다(Photo 2, Figure 4).
- 그리고 아직은 상품화된 약으로 시판되고 있지는 않지만 파괴된 치주조직 재생의 보조제로 연구되고 있는 홍화는 동양의학에서 울혈을 위한 치료제로 전래되는약제로서 골재생 효과가 있다고 여겨져 많은 연구들이 행해지고 있다. 그 결과들로 홍화추출물은 치주 인대 세포, 조골세포의 기능적 활성화 및 백서 두개골 결손부에서 신생골 형 성 촉진효과를 확인한 바 있고끄), 홍화추출물 처리에 의한 증가된 ALP합성은 세포외기질에 calcium phosphate를 침착시켜 골 형성의 핵 역할을 함으로써 석화화를 유도하여 치주 인대 세포 및 조골세포의 분화와 성숙에 관여함이 밝혀졌다 28). 이 밖에도 여러 생약들이 연구되고 있으며 이들은 오랜기간 동양의학에서 사용되어 온 약제로서 경험적으로 그 안전성과 효과가 인정되어 사용되어 온바 있으므로, 비교적 부작용 없이 경구투여가 가능한 약재로 기대된다고 할 수 있다.
- 그리고 4일째에는 농도가 0.1 經/ml에서 1 經/ml 으로 증가하면서 세포활성도가 높았으나, 농도가 10 經/ml로 증가하면서 세포활성도가 낮아 dexametha- sone을 사용한 대조군보다 유의 성은 없었지 만 더 낮은 결과를 나타내었고, 1 經/ml군이 모든 군에 비해유의성이 있는 결과를 나타내었다(Table 1, Figure 1). 이러한 세포활성도의 증가는 초기 세포의 증식단계에서 여러 층을 형성할 수 있다는 것을 나타내고이는 골결절 형성의 초기에 도움을 줄 것으로 사료된다.
- Mukai 등32)의 실험에서는 결절내에 조골세포나골세포와 유사한 세포들 및 교원기질과 기질낭포 (matrix vesicle)가 존재하며, 이 결절이 수산화인회석의 결정구조를 가짐을 관찰하였다. 본 연구에서는 1 經/ml, 10 經/ml의 유향 추출물을 MC3T3-E1 세포에 투여하고 21일 동안 배양한 후 석회화 골결절의면적을 합산하여 각각의 측정치를 전체면적으로 나누어 백분율로 환산하였는데, 음성 대조군에 비해 양성대조군 및 실험군에서 석회화 결절이 많이 관찰되었고, 1 經/ml군에서 가장 많은 석회화 결절이 관찰되었으며 음성대조군에 비해 4배정도증가된 면적을보여주었다(Photo 1, Figure 3).
- 이러한 골관련 단백질은 칼슘염과 인산염에 결합하는 성질을 가지며 수산화인회석 결정체 형 성의 핵으로 작용하고핵의 성장과 용해와 같은 조절과정에도 관여할 것이다. 본 연구에서는 유향 추출물 0.1 經/ml, 1 經/ml, 10 經/ml을 MC3T3-E1 세포에 투여하여, 골재형성과재생이 일어나는 부위에서 국소적 인산이온 농도를증가시키는 ALP의 합성을 측정한 결과 2일째에는 실험군과 대조군간 유의한 차이는 없었으나, 1 經/ml 군이 가장 높은 ALP합성을 보였고, 4일째에는 1 經 /ml군이 다른 군과 비교시 통계적 유의성을 보이며가장 높은 ALP합성을 보였다(Table 2, Figure 2). 유향을 조골세포에 처리하여 증가된 ALP 합성은 세포외 기질에 calcium phosphate를 침착시켜 골 형성의핵 역할을 함으로써 석회화를 유도하여 조골세포의분화와 성숙에 중요한 기능을 할 것으로사료된다.
- 세포활성도를 시험하기 위한 MTT 분석에서, 조골모유사세포에 유향 추출물을 처리하여 얻은 결과, MC3T3-E1세포에 대해 2일째에는 군간의 유의 성이없었으나 1 經/ml군이 가장 많은 세포활성도를 보였다. 그리고 4일째에는 농도가 0.
- T3-E1 세포에 투여하고 21일 동안 배 양한 후 각 군마다 석회 화 골결절의 면적을 합산하여 각각의 측정치를 전체 면적으로 나누어 백분율로 환산한 결과는 그림 3과 같다. 음성 대조군에 비해 양성대조군 및 실험군에서 석회화 결절이 많이 관찰되었고, 1 經/ml군에서 가장 많은 석회화 결절이 관찰되었으며 음성대조군 에 비해 4배정도 증가된 면적을 보여주었다(Photo 1, Figure 3).
- 1 經/ml에서 1 經/ml 으로 증가하면서 세포활성도가 높았으나, 농도가 10 經/ml로 증가하면서 세포활성도가 낮아 dexametha- sone을 사용한 대조군보다 유의 성은 없었지 만 더 낮은 결과를 나타내었고, 1 經/ml군이 모든 군에 비해유의성이 있는 결과를 나타내었다(Table 1, Figure 1). 이러한 세포활성도의 증가는 초기 세포의 증식단계에서 여러 층을 형성할 수 있다는 것을 나타내고이는 골결절 형성의 초기에 도움을 줄 것으로 사료된다.
후속연구
- 이상과 같은 소견으로 유향이 조골모유사세포에대한 세포활성의 증가와 ALP 합성능의 증가 그리고골조직의 재생 에 있어 중요한 골결절의 형성과 세포외 기질로 작용하여 골 광물화에 기 여하는 collagen 의 발현에 영향을 미치는 점으로 미루어, 유향은 골세포의 활성과 분화에 영향을 미칠 수 있고, 치주조직 재생제로의 이용가능성이 높다고 생각되며, 임상적 활용 방안을 모색할 필요가 있으리라사료된다.
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