MC3T3-E1 세포주에서 황기.계지.황백 처방(BHH10)의 골형성 촉진 효능 연구 Effects of Astragalus Membranaceus, Innamomum Cassia, Phellodendron Amurensis(BHH10) on MC3T3-E1 Cells Proliferation, Differntiation and Bone Mineralized Formation원문보기
Objectives : BHH10 is traditional medicine herb used for enhancing body resistance against various diseases. The aim of this study was to identify BHH10 extract induces osteogenic activity in human osteoblast-like MC3T3-E1 cells. Methods : MC3T3-E1, pre-osteoblast cell line, were treated with BHH10 ...
Objectives : BHH10 is traditional medicine herb used for enhancing body resistance against various diseases. The aim of this study was to identify BHH10 extract induces osteogenic activity in human osteoblast-like MC3T3-E1 cells. Methods : MC3T3-E1, pre-osteoblast cell line, were treated with BHH10 of various concentrations($0.1{\mu}g/mL$, $1{\mu}g/mL$, $10{\mu}g/mL$). And then, the effect of BHH10 on osteoblast differentiation was examined by alkaline phosphatase(ALP) activity, von Kossa staining and RT-PCR for osteoblast differentiation markers such as osteocalcin(OCN), osteopontin(OPN). Results : BHH10 had dose-dependent effect on the viability of osteoblastic cells, and dose-dependently increased alkaline phosphatase(ALP) activity. BHH10 markedly increased mRNA expression for OCN, OPN in MC3T3-E1 cells. Also, BHH10 significantly induced mineralization in the culture of MC3T3-E1 cells. Conclusions : In conclusion, these results propose that BHH10 can play an important role in osteoblastic bone formation, osteogenesis, and may possibly lead to the development of bone-forming drugs.
Objectives : BHH10 is traditional medicine herb used for enhancing body resistance against various diseases. The aim of this study was to identify BHH10 extract induces osteogenic activity in human osteoblast-like MC3T3-E1 cells. Methods : MC3T3-E1, pre-osteoblast cell line, were treated with BHH10 of various concentrations($0.1{\mu}g/mL$, $1{\mu}g/mL$, $10{\mu}g/mL$). And then, the effect of BHH10 on osteoblast differentiation was examined by alkaline phosphatase(ALP) activity, von Kossa staining and RT-PCR for osteoblast differentiation markers such as osteocalcin(OCN), osteopontin(OPN). Results : BHH10 had dose-dependent effect on the viability of osteoblastic cells, and dose-dependently increased alkaline phosphatase(ALP) activity. BHH10 markedly increased mRNA expression for OCN, OPN in MC3T3-E1 cells. Also, BHH10 significantly induced mineralization in the culture of MC3T3-E1 cells. Conclusions : In conclusion, these results propose that BHH10 can play an important role in osteoblastic bone formation, osteogenesis, and may possibly lead to the development of bone-forming drugs.
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문제 정의
본 연구는 골다공증, 골형성 촉진 및 골유합 기반 기술을 응용한 선행연구를 바탕으로 자신환 가감방인 BHH10처방의 골형성 촉진의 효능을 연구하였다. Mouse pre-osteoblast cell인 MC3T3-E1에서의 골형성 관련 최적조건을 ALP활성과 mineralization, 골형성 유전자 발현을 확인함으로서 확립하였다.
본 연구에서는 mouse pre-osteoblast cell인 MC3T3-E1에서의 골형성 관련 최적조건 확립 및 BHH10의 효능을 연구하였다.
제안 방법
1.8 % agarose gel(Carl ROTH)을 건조한 후 PCR 산물을 6× loading buffer 4 ㎕와 혼합하여 90 V에서 40분간 전기영동 하였다.
BHH10의 개발 경위를 자세하게 살펴보면 민간요법, 중국ㆍ일본 및 국내외 한의학 고전 처방, 각종 임상 논문 및 보고서 등 관련 문헌을 통해 신허강화(腎虛降火) 할 수 있는 처방 및 한약제를 선정하였다. 1차적으로 처방 및 한약제 중 동물성ㆍ광물성, 강한 독성이 있는 처방 및 약제는 선별하여 배제하였고, 특허 출원 조사에 따라 후보처방 및 한약제를 72종으로 압축하여 선정하였다. 이를 대상으로 골형성 활성을 탐색, 분석, 평가하여 골재형성에 우수한 효능이 있는 처방 10종을 선별하였다.
0 microscope, carl zeiss Inc, Weimar, Germany) 관찰 후 사진 촬영 (100×)하였다. ALP의 intensity는 isolution image분석 software를 이용하여 측정하였다(IMT echnology, Canada).
BHH10은 조골세포에 대해 독성이 없으면서 우수한 활성을 보여 이를 농도별로 처리하였다.
BHH10의 개발 경위를 자세하게 살펴보면 민간요법, 중국ㆍ일본 및 국내외 한의학 고전 처방, 각종 임상 논문 및 보고서 등 관련 문헌을 통해 신허강화(腎虛降火) 할 수 있는 처방 및 한약제를 선정하였다. 1차적으로 처방 및 한약제 중 동물성ㆍ광물성, 강한 독성이 있는 처방 및 약제는 선별하여 배제하였고, 특허 출원 조사에 따라 후보처방 및 한약제를 72종으로 압축하여 선정하였다.
BHH10이 10 ㎍/mL 처리된 MC3T3-E1 세포주에서의 유전자 발현양을 RT-PCR로 측정하였다. OCN 은 14일째 가장 높은 증가율을 보였다.
본 연구는 골다공증, 골형성 촉진 및 골유합 기반 기술을 응용한 선행연구를 바탕으로 자신환 가감방인 BHH10처방의 골형성 촉진의 효능을 연구하였다. Mouse pre-osteoblast cell인 MC3T3-E1에서의 골형성 관련 최적조건을 ALP활성과 mineralization, 골형성 유전자 발현을 확인함으로서 확립하였다. 또 pre-osteoblast MC3T3-E1 세포주의 골형성 분화 최적 조건을 확립한 후 BHH10처방이 골 형성에 미치는 영향을 검토하고자 BHH10을 농도별로 osteoblastic MC3T3-E1 세포주에 처리하여 그 효능을 확인하였다.
Osteogenic으로 분화를 유도한 후 이를 확인하기 위하여 세포를 silver nitrate 용액으로 처리하여 조직 내에 침착된 calcium염에서 calcium 대신 은이온을 치환시킨 후 흑갈색으로 침착된 calcium의 정도를 측정하게 된다.
Total RNA preparation → reverse transcription → PCR → gel running → EtBr staining → UV에서 관찰 및 촬영하였다.
sodium thiosulfate solution(von Kossa stain kit)으로 2분간 실온에서 반응시킨 후 nuclear fast red solution(von Kossa stain kit)을 5분간 반응하여 멸균수로 세정하고 현미경 관찰 후 사진 촬영하였다(100×).
앞에서 시행된 조골세포주 분화에 따른 시간별 ALP의 변화 확인 결과 7일째 가장 높게 나타남을 확인하였다. 그 결과에 따라 BHH10이 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 분화배지에서 7일 동안 BHH10을 농도별로 처리하였다. ALP의 효소활성을 현미경으로 관찰한 결과 BHH10을 1 ㎍/mL 처리했을 때 가장 많이 ALP가 염색되었으며(Fig.
Mouse pre-osteoblast cell인 MC3T3-E1에서의 골형성 관련 최적조건을 ALP활성과 mineralization, 골형성 유전자 발현을 확인함으로서 확립하였다. 또 pre-osteoblast MC3T3-E1 세포주의 골형성 분화 최적 조건을 확립한 후 BHH10처방이 골 형성에 미치는 영향을 검토하고자 BHH10을 농도별로 osteoblastic MC3T3-E1 세포주에 처리하여 그 효능을 확인하였다. 실험결과 ALP의 활성은 7일째 가장 높았으며, von Kossa염색결과 14일째가 가장 높았다.
1～10 ㎍/mL 까지 농도 의존적으로 증가시켰다. 또한 BHH10 10㎍/mL 을 처리한 조골세포주에서 osteoblast분화 marker인 OCN, OPN을 조사하였다. 그 결과 OCN과 OPN 모두 14일째 발현 양이 가장 높게 나타났다.
멸균수로세정하고 hematoxyline 용액(Sigma, Louis, MO, USA)으로 2분간 counterstain하여 다시 멸균된 증류수로 세정하고 현미경(Axio vision 4.0 microscope, carl zeiss Inc, Weimar, Germany) 관찰 후 사진 촬영 (100×)하였다.
시료의 세포독성을 측정하기 위해 water-soluble type이 WST-8을 이용한 CCK-8(cell counting kit-8) 로 측정하였다. 배양한 세포를 0.4 % trypan blue염색 법으로 세포수를 측정한 후 1x104cells/well의 농도로 96well-plate에 100 ㎕씩 분주하고 성장배지로 24시간 배양하였다. 새로운 α-MEM 분화배지에 BHH10을 농도별(0, 0.
본 실험에서는 MC3T3-E1 세포주에 7일, 14일, 18일, 21일 동안 분화배지에서 배양 후 von Kossa염색을 실시하였다.
본 실험에서는 MC3T3-E1 세포주에 7일, 14일, 18일, 21일 동안 분화배지에서 배양 후 조골세포의 골형성 촉진 유전자인 OCN, OPN의 발현 변화량을 RT-PCR 로 측정하였다.
본 실험에서는 MC3T3-E1 세포주에 7일, 14일, 18일, 21일 동안 분화배지에서 배양 후 조골세포의 분화를 ALP 염색을 통하여 발현 정도를 확인하였다.
분화배지에서 7, 14, 18, 21일 동안 배양된 세포에 alkaline phosphatase 염색(Sigma, Louis, MO, USA) 을 하였다. 배양된 세포의 배양액을 제거한 후 PBS로두 번 세척하였다.
분화배지에서 7, 14, 18, 21일 동안 배양된 세포에 von Kossa(von Kossa stain kit, IHC World, LLC, Woodstock, MD, USA)염색을 하였다. 배양된 세포의 배양액을 제거하고 PBS로 두 번 세척하였다.
분화배지에서 7, 14, 18, 21일 동안 배양된 세포에서 RNA를 분리하였다. RNA검출 과정은 세 단계로 진행 하였다.
새로운 α-MEM 분화배지에 BHH10을 농도별(0, 0.1, 1, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL)로 각 well에 넣었다.
성장배지로 세포를 6-well에(5×104cells/well)분주 하여 90 % 가량 자라면 분화유도배지[differentiation medium(DM): a-MEM(WelGENE, Daegu, Korea)에 10 mM β-glycerophosphate (Sigma, Louis, MO, USA)와 50 ㎍/mL ascorbic acid(Sigma) 첨가]에 두 조건으로 나누어 7, 14, 18, 21일간 3일마다 배지를 교환하여 배양하였다.
세포를 6-well에 (5×104 cells/well)분주하여 90 %가량 자라면 BHH10을 농도별 (0, 0.1, 1, 10 ㎍/mL) 로 각 well에 처리하고, 7, 14, 18, 21일 동안 배양한후 골형성 관련 유전자(OPN, OCN)를 확인 하였다.
시료의 세포독성을 측정하기 위해 water-soluble type이 WST-8을 이용한 CCK-8(cell counting kit-8) 로 측정하였다. 배양한 세포를 0.
염색된 세포는 현미경(Axio vision 4.0 microscope, carl zeiss Inc, Weimar, Germany) 관찰 후 사진 촬영 (100×)하였다.
1, 1, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL의 모든 농도에서 95 % 이상의 높은 생존율을 보여 세포독성이 없음을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 BHH10을 조골세포주에 농도별로 처리하여 von Kossa staining을 통하여 조골세포의 발현을 확인하였다. BHH10은 7일째 ALP를 증가시켰고, 저농도인 1 ㎍/mL에서 높은 효과를 확인하였다.
앞선 조골세포주 분화에 따른 시간별 골형성 유전자 발현을 확인한 결과, 골형성에 관여하는 유전자 OCN, OPN은 14일째 가장 높게 발현함을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 BHH10을 처리한 조골세포주에서 osteoblast분화 marker인 OCN, OPN을 조사 하였다.
조골세포주 분화에 따른 시간별 mineralization 실험을 통하여 14일째 칼슘의 축적이 가장 높음을 확인하였다. 이를 바탕으로 BHH10이 처리된 조골세포주의 mineralization을 조사하였다.
대상 데이터
Mouse calvarial osteoblast MC3T3-E1(subclone 4) 세포주를 American Type Culture Collection(VA) 로부터 구입하여 사용하였다. MC3T3-E1세포를 2～3일마다 계대배양하여 passage #4부터 #6까지 사용하였다. 세포는 α-minimal essential medium(WelGENE, Daegu, South korea) 배지에서 10 % FBS(Lozga, Walkersville, MD, USA), 1 % Antibiotics(WelGENE, Daegu, Korea)가 첨가된 성장배지(growth Medium: GM)로 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양하였다.
Mouse calvarial osteoblast MC3T3-E1(subclone 4) 세포주를 American Type Culture Collection(VA) 로부터 구입하여 사용하였다. MC3T3-E1세포를 2～3일마다 계대배양하여 passage #4부터 #6까지 사용하였다.
세포는 α-minimal essential medium(WelGENE, Daegu, South korea) 배지에서 10 % FBS(Lozga, Walkersville, MD, USA), 1 % Antibiotics(WelGENE, Daegu, Korea)가 첨가된 성장배지(growth Medium: GM)로 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양하였다.
1차적으로 처방 및 한약제 중 동물성ㆍ광물성, 강한 독성이 있는 처방 및 약제는 선별하여 배제하였고, 특허 출원 조사에 따라 후보처방 및 한약제를 72종으로 압축하여 선정하였다. 이를 대상으로 골형성 활성을 탐색, 분석, 평가하여 골재형성에 우수한 효능이 있는 처방 10종을 선별하였다. In vivo 및 in vitro 연구를 통하여 골다공증 및 골유합에 가장 뛰어난 효과가 있는 자신환(滋腎丸)의 가감방인 BHH10처방을 개발하게 되었다15,25,26).
데이터처리
실험결과는 GraphPad prism을 이용하여 paired t-test 통계처리 하였다.
성능/효과
ALP염색 결과, 7일째에 ALP 활성이 가장 많이 증가하였고, 14, 18, 21일째로 가면서 점차 감소하였다 (Fig. 2).
그 결과에 따라 BHH10이 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 분화배지에서 7일 동안 BHH10을 농도별로 처리하였다. ALP의 효소활성을 현미경으로 관찰한 결과 BHH10을 1 ㎍/mL 처리했을 때 가장 많이 ALP가 염색되었으며(Fig. 6A), ALP효소의 활성을 isolation image로 분석한 결과 역시 1 ㎍/mL의 저농도에서 분화배지만 처리한 군보다 증가함을 확인하였다(Fig. 6B).
이러한 결과를 바탕으로 BHH10을 조골세포주에 농도별로 처리하여 von Kossa staining을 통하여 조골세포의 발현을 확인하였다. BHH10은 7일째 ALP를 증가시켰고, 저농도인 1 ㎍/mL에서 높은 효과를 확인하였다. Von Kossa염색을 통하여 calcium의 침착을 확인한 결과 0.
BHH10의 MC3T3-E1세포 증식에 미치는 영향을 관찰 한 결과, 0.1, 1, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL의 모든 농도에서 95 % 이상의 높은 생존율을 보여 세포독성이 없음을 확인 하였다(Fig. 5).
BHH10처방이 세포독성이 없고, ALP활성과 mineralization을 초기에 저농도에서 증가시키며, 골 형성 촉진 효능이 우수함을 확인하였다.
7A). Staing된 particle의 number를 counting한 결과 역시 0.1, 1, 10 ㎍/mL 모든 농도에서 particle의 수가 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 7B).
Von Kossa염색을 통하여 칼슘의 침착정도를 현미경으로 확인한 결과 0.1, 1, 10 ㎍/mL에서 모두 증가 함을 확인하였다(Fig. 7A). Staing된 particle의 number를 counting한 결과 역시 0.
결과적으로 BHH10의 처리가 골형성 관련 유전자의 발현양을 증가시킨다는 것을 확인 할 수 있었다.
실험결과 ALP의 활성은 7일째 가장 높았으며, von Kossa염색결과 14일째가 가장 높았다. 골 형성 관련 유전자인 OCN과 OPN은 14일째 골형성 촉진이 가장 우수했다.
또한 BHH10 10㎍/mL 을 처리한 조골세포주에서 osteoblast분화 marker인 OCN, OPN을 조사하였다. 그 결과 OCN과 OPN 모두 14일째 발현 양이 가장 높게 나타났다.
또 조골세포주의 세포성장에 BHH10이 미치는 영향을 관찰하였고, 0.1, 1, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL의 모든 농도에서 95 % 이상의 높은 생존율을 보여 세포독성이 없음을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 BHH10을 조골세포주에 농도별로 처리하여 von Kossa staining을 통하여 조골세포의 발현을 확인하였다.
4배 증가 하였다. 시간 변화에 따른 조골세포의 골형성 유전자 OPN, OCN은 14일째 가장 높게 발연함을 확인하였다(Fig. 4B).
실험 결과, OCN은 각 날짜별 대조군(GM)과 비교 했을 때 14일째 약 12배 유의성 있게 증가하였고, 18일째에 약 2.3배 증가하였다(Fig. 4A). OPN도 각 날짜별 대조군(GM)과 비교했을 때 OPN과 마찬가지로, 14일째 약 6배 증가하여 날짜별 가장 높은 발현 양을보였으며 18일째는 약 1.
또 pre-osteoblast MC3T3-E1 세포주의 골형성 분화 최적 조건을 확립한 후 BHH10처방이 골 형성에 미치는 영향을 검토하고자 BHH10을 농도별로 osteoblastic MC3T3-E1 세포주에 처리하여 그 효능을 확인하였다. 실험결과 ALP의 활성은 7일째 가장 높았으며, von Kossa염색결과 14일째가 가장 높았다. 골 형성 관련 유전자인 OCN과 OPN은 14일째 골형성 촉진이 가장 우수했다.
앞선 조골세포주 분화에 따른 시간별 골형성 유전자 발현을 확인한 결과, 골형성에 관여하는 유전자 OCN, OPN은 14일째 가장 높게 발현함을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 BHH10을 처리한 조골세포주에서 osteoblast분화 marker인 OCN, OPN을 조사 하였다.
앞에서 시행된 조골세포주 분화에 따른 시간별 ALP의 변화 확인 결과 7일째 가장 높게 나타남을 확인하였다. 그 결과에 따라 BHH10이 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 분화배지에서 7일 동안 BHH10을 농도별로 처리하였다.
염색 결과 7일, 14일, 18일, 21일로 시간이 증가함에 따라 칼슘축적이 증가하였고, 14일째 칼슘의 축적이 가장 많이 발현되었다(Fig. 3).
OCN 은 14일째 가장 높은 증가율을 보였다. 음성대조군 (GM)에 비하여 양성대조군(DM)에서 1.6배 증가 하였고, BHH10 처리 시 1.5배 더 증가하였다(Fig. 8A). OPN 역시 14일째 BHH10을 처리한 군이 분화배지만 처리한 양성대조군 보다 높은 발현 양을 나타내었다 (Fig.
조골세포주 분화에 따른 시간별 mineralization 실험을 통하여 14일째 칼슘의 축적이 가장 높음을 확인하였다. 이를 바탕으로 BHH10이 처리된 조골세포주의 mineralization을 조사하였다.
후속연구
본 연구진은 앞으로 골다공증 동물모델에서의 BHH10처방의 골 형성 촉진 및 골 파괴 억제 효능과 기전 보완 연구를 통해 부작용을 최소화하고, 복용하기 편리하며, 골재형성 효능이 확보된 새로운 골다공증 한약제제로 개발하여 현재 임상에서 사용 중인 골다공증치료제(estradiol 및 alrendronate)의 단점이 보완된 한방치료제로 개발하고 한방이론의 과학화에 기여할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
현대 의학에선 골의 재형성 과정은 어떻게 설명하는가?
골은 석회화된 견고한 표면과 골수로 불리는 내부의 세포 성분이 결합된 특수조직이다. 생리적으로 상이한 이 두 구조의 결합은 일생을 두고 지속되는 골의 재형성(bone remodeling) 과정에 기인한 것인데, 이는 골에 가해지는 호르몬이나 물리적 자극에 의해 골수에 있는 파골세포(osteoclast)들이 골의 표면으로 모여 골을 파들어가면서 파괴하는 골 흡수(bone resorption)가 일어난 자리에 모여든 조골세포(osteoblast) 에 의한 골기질의 합성(bone formation)으로 설명된다1). 골 표면에 위치하는 조골세포는 세포막에 당단백 효소인 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)를 가지고 있으며 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테오폰틴(osteopontin,OPN), 뼈 시알로단백(bone sialoprotein, BSP)과 같은 골 기질 물질을 분비하고 석회화시키는 역할을 한다2).
Astragalus membranaceus BGE의 한의학적 효능은 무엇인가?
황기의 효능으로는 보기승양(補氣升陽), 고표지한 (固表止汗: 피부의 방어기능을 강화하여 땀을 멈추게 하는 치료법), 이수소종(利水消腫: 배뇨를 원활하게 하여 부은 것을 가라앉게 하는 치료법), 탁독배농(托毒排膿: 기혈을 보익하는 약물을 사용하여 정기를 보조해서 병독을 밖으로 밀어 냄으로써 내부의 농을 배출하는 치료법) 등이 있다. 따라서 황기는 만성 쇠약, 특히 비위기(脾胃氣) 허약에 효과가 있으며, 중추신경계의 흥분작용 효과도 있다. 최근 연구 보고에 따르면, 황기는 면역력을 높여주며 조혈기능을 높여줌으로써 방사선치료를 받고 있는 암환자의 치료 및 회복에 도움을 주는 처방에 사용한다고 보고되었으며15), 난소 절제술을 실시한 동물모델(OVA rat model)에 황기 분획 추출물을 경구함으로써 골 대사 작용을 촉진시키는 결과 등이 보고된 바 있다10). 그러나 현재까지 황기의 골 파괴 억제，골 형성 및 골 재생 촉진에 의한 치료 효과가 보고된 바는 없다.
골이란 어떤 조직을 일컫는가?
골은 석회화된 견고한 표면과 골수로 불리는 내부의 세포 성분이 결합된 특수조직이다. 생리적으로 상이한 이 두 구조의 결합은 일생을 두고 지속되는 골의 재형성(bone remodeling) 과정에 기인한 것인데, 이는 골에 가해지는 호르몬이나 물리적 자극에 의해 골수에 있는 파골세포(osteoclast)들이 골의 표면으로 모여 골을 파들어가면서 파괴하는 골 흡수(bone resorption)가 일어난 자리에 모여든 조골세포(osteoblast) 에 의한 골기질의 합성(bone formation)으로 설명된다1).
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