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문제 정의
- 일부 연구에서 대변내 로타바이러스의 유전자에 대한 역전사 중합효소 증폭법(Reverse transcription-Polymerase chain reaction, RT-PCR)이 ELISA보다 100∼1000배 이상의 예민도를 보이는 것으로 보고된 바 있다17∼19). 이에 본 연구에서는 RT-PCR을 ELISA나 LA와 비교하여 예민도를 판정함으로써 RT-PCR이 임상적으로 로타 바이러스 감염 유무를 판단하는 진단 술기로서 유용한지를 알고자 하였다.
- 이는 1990년 Gouvea 등21)의 연구와 1992년 Ushijima 등31)의 연구 결과에서도 볼 수 있는 것으로 RT-PCR 도중에 발생하는 비특이적 반응 억제물질에 의한 억제반응 때문인데 이러한 억제 반응은 대변 검체내에서 RNA 바이러스를 검출하는 데 있어 심각한 제한을 야기시키는 것으로 알려져 있으며 현재 이러한 반응 억제 물질의 제거법이 다양하게 제시되고 있다18∼20). 이에 본 연구에서는 설사하는 환아의 대변에서 동시에 RT-PCR과 immunoassay를 시행하여 로타바이러스의 검출률을 비교함으로써 로타바이러스 장염을 진단하는 데 있어 각 검사의 효율을 비교하고자 하였다.
제안 방법
- QIAmp viral RNA mini kit (QIAGIN, USA)를 사용하여 대변 상층액으로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR에 사용하였다. RT-PCR의 조건을 간략하면 먼저 cDNA 합성을 위해 추출한 RNA 10 microL를 97℃에서 5분 간 가열하고 반응액으로 Superscript II (Gibco, USA) 5×buffer 2 microL, 2.
- 5 microL를 첨가하고 42℃에서 1시간 반응시켰다. cDNA 합성 후 94℃에서 1분, 42℃에서 2분, 72℃에서의 5분 간 반응을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 5분 간 반응시켜 증폭시켰고 증폭된 반응물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 사용한 primer는 VP4의 경우 Gentsh 등20)이 사용한 것을, VP7의 경우 Vera 등21)이 사용한 것을 기본으로 하였는데 각 염기서열은 Table 1에 기술하였다.
- 각 검사의 위양성률과 위음성률을 알기 위해서는 먼저 로타바이러스 감염의 절대적인 비교 표준을 정하여야 하는데 이를 위해 본 검사에서는 일반적으로 알려진 예민도의 순서를 기준으로 하여 예민도가 낮은 검사에서 양성인 경우를 예민도가 높은 검사의 위음성 기준으로 하고 예민도가 높은 검사의 음성을 예민도가 낮은 검사의 위양성 기준으로 하여 각 검사의 위양성률과 위음성률을 비교 하였다. 일반적으로 LA 검사의 예민도가 가장 떨어지고 RT-PCR의 예민도가 가장 높은 것으로 알려져 있으므로 LA 양성인 경우를 ELISA와 RTPCR의 위음성 기준으로 하여 LA가 양성임에도 불구하고 ELISA나 RT-PCR이 음성이면 위음성으로 하였고 RT-PCR 음성을 LA와 ELISA의 위양성 기준으로 하여 RT-PCR이 음성임에도 불구하고 LA 나 ELISA가 양성이면 위양성으로 하였다.
- Solid phase enzyme immunoassay로서 로타텍 키트(녹십자)를 사용하였다. 검사방법을 간략하면 Rotavirus 항체가 부착된 plate에 대변 상층액을 반응시키고 이에 형광물질을 부착한 2차 항체를 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 0.2 이상인 경우를 양성으로 판정하였다.
- 로타 바이러스 라텍스 키트(일본 영연화학)를 사용하여 검사하였다. 검사방법을 간략하면 대변 상층액을 anti-human Rotavirus latex와 잘 섞은 후 응집이 생기는 경우를 양성으로 판정하였다.
- 그러나 이러한 수치는 RT-PCR이나 LA 자체의 위양성률이나 위음성률을 고려하지 않은 것으로 RT-PCR 자체의 위양성률과 LA 자체의 위음성률을 고려한다면 각 검사의 위양성률과 위음성률은 그보다 더 높을 수 있다. 따라서 이러한 수치만으로 각 검사를 비교하기가 어려워서 두 진단법 사이의 일치도를 카파값을 구하여 알아 보았다. Table 6에서 RT-PCR과 ELISA 사이의 카파값이 0.
- 목 적: 로타바이러스에 의한 장염의 진단에서 RT-PCR을 ELISA나 LA와 비교하여 각 검사의 효율을 비교하였다.
- 방 법: 설사증을 주소로 내원한 유소아의 대변에서 ELISA나 LA에 의한 로타바이러스 항원 검출률과 RT-PCR에 의한 로타바이러스 유전자 검출률을 비교하였다.
- 각 검사의 위양성률과 위음성률을 알기 위해서는 먼저 로타바이러스 감염의 절대적인 비교 표준을 정하여야 하는데 이를 위해 본 검사에서는 일반적으로 알려진 예민도의 순서를 기준으로 하여 예민도가 낮은 검사에서 양성인 경우를 예민도가 높은 검사의 위음성 기준으로 하고 예민도가 높은 검사의 음성을 예민도가 낮은 검사의 위양성 기준으로 하여 각 검사의 위양성률과 위음성률을 비교 하였다. 일반적으로 LA 검사의 예민도가 가장 떨어지고 RT-PCR의 예민도가 가장 높은 것으로 알려져 있으므로 LA 양성인 경우를 ELISA와 RTPCR의 위음성 기준으로 하여 LA가 양성임에도 불구하고 ELISA나 RT-PCR이 음성이면 위음성으로 하였고 RT-PCR 음성을 LA와 ELISA의 위양성 기준으로 하여 RT-PCR이 음성임에도 불구하고 LA 나 ELISA가 양성이면 위양성으로 하였다.
대상 데이터
- 1999년 12월부터 2000년 2월까지 고대병원 소아과에 입원하여 설사 증상을 보인 영유아 79명을 대상으로 하였다. 대변은 채취 즉시 -70℃에 보관하였다가 Phosphate buffered saline (1×)을 사용하여 10%로 희석하였고 160 g에서 10분 간 원심분리한 후 상층액을 검사에 사용하였다.
- Solid phase enzyme immunoassay로서 로타텍 키트(녹십자)를 사용하였다. 검사방법을 간략하면 Rotavirus 항체가 부착된 plate에 대변 상층액을 반응시키고 이에 형광물질을 부착한 2차 항체를 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 0.
- 로타 바이러스 라텍스 키트(일본 영연화학)를 사용하여 검사하였다. 검사방법을 간략하면 대변 상층액을 anti-human Rotavirus latex와 잘 섞은 후 응집이 생기는 경우를 양성으로 판정하였다.
- cDNA 합성 후 94℃에서 1분, 42℃에서 2분, 72℃에서의 5분 간 반응을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 5분 간 반응시켜 증폭시켰고 증폭된 반응물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 사용한 primer는 VP4의 경우 Gentsh 등20)이 사용한 것을, VP7의 경우 Vera 등21)이 사용한 것을 기본으로 하였는데 각 염기서열은 Table 1에 기술하였다.
이론/모형
- 0에 가까운 수치로 나타낸다. 카파값은 일반적으로 사용되는 전체일치도(Overall percent agreement)에 우연에 의한 일치의 정도를 보정한 지표(chance-corrected agreement)를 이용하였다22). Landis와 Koch23)는 카파값이 0.
성능/효과
- Table 3에서 RT-PCR과 ELISA에 의한 검사 결과를 비교하였다. ELISA 검사 결과를 기준으로 하였을 때 RT-PCR에서 음성인 경우 31례 중 ELISA에서 양성인 경우가 8례가 있어 RT-PCR의 위음성률은 25%이었고 RT-PCR 검사 결과를 기준으로 하였을 때 ELISA에서 양성인 경우 45례 중 RT-PCR에서 음성인 경우가 8례가 있어 ELISA 검사의 위 양성률은 18%이었다(Table 5).
- Table 4에서 LA와 ELISA 검사 결과를 비교하였다. LA 검사 결과를 기준으로 하였을 때 ELISA에서 음성인 경우 34례 중 LA에서 양성인 경우가 14례가 있어 ELISA의 위음성률은 41%이었고 ELISA 검사 결과를 기준으로 하였을 때 LA에서 양성인 경우 45례 중 ELISA에서 음성인 경우가 14례가 있어 LA 검사의 위양성률은 31%이었다(Table 5).
- Table 2에서 RT-PCR과 LA에 의한 검사 결과를 비교하였다. LA 검사 결과를 기준으로 하였을 때 RT-PCR에서 음성인 경우 31례 중 LA에서 양성인 경우가 11례가 있어 RT-PCR의 위음성률은 35%이었고 RT-PCR 검사 결과를 기준으로 하였을 때 LA에서 양성인 경우 45례 중 RT-PCR에서 음성인 경우가 11례가 있어 LA 검사의 위양성률은 24%이었다(Table 5).
- Table 5에서 각 검사의 위양성률을 비교하면 RT-PCR은 자체가 위양성률의 비교 기준이 되었으므로 RT-PCR의 위양성률을 정할 수는 없었고 LA 는 ELISA와 RT-PCR과 비교하였을 때 위양성률이 각각 24%와 31%이었으며 ELISA는 RT-PCR과 비교하였을 때 18%이었다. 마찬가지로 각 검사의 위 음성률을 비교하면 LA는 자체가 위음성률의 비교 기준이 되었으므로 LA의 위음성률을 정할 수는 없었고 RT-PCR은 LA와 ELISA와 비교하였을 때 위음성률이 각각 35%와 25%이었으며 ELISA는 LA와 비교하였을 때 41%이었다.
- 마찬가지로 각 검사의 위 음성률을 비교하면 LA는 자체가 위음성률의 비교 기준이 되었으므로 LA의 위음성률을 정할 수는 없었고 RT-PCR은 LA와 ELISA와 비교하였을 때 위음성률이 각각 35%와 25%이었으며 ELISA는 LA와 비교하였을 때 41%이었다. 각 검사별로 보았을 때 위양성률은 RT-PCR과 비교하여 LA는 31%, ELISA는 18%로서 ELISA가 LA보다 우수하였으나 위음성률은 LA와 비교하여 RT-PCR은 35%, ELISA는 41%로서 RT-PCR과 ELISA는 의미 있는 차이를 보이지 않았는데 이러한 차이는 간접적인 특이도의 차이로도 볼 수 있다. 그러나 이러한 수치는 RT-PCR이나 LA 자체의 위양성률이나 위음성률을 고려하지 않은 것으로 RT-PCR 자체의 위양성률과 LA 자체의 위음성률을 고려한다면 각 검사의 위양성률과 위음성률은 그보다 더 높을 수 있다.
- 결 과: 대변에서 로타바이러스 감염을 진단하는데 있어 ELISA는 LA보다 우월하며 RT-PCR과 특이도의 의미있는 차이없이 상당한 일치를 보였다.
- 결 론: 로타바이러스 장염의 진단에서 ELISA는 LA보다 우월하며 RT-PCR은 ELISA 보다 의미있게 우월하지는 않았다.
- Table 5에서 각 검사의 위양성률을 비교하면 RT-PCR은 자체가 위양성률의 비교 기준이 되었으므로 RT-PCR의 위양성률을 정할 수는 없었고 LA 는 ELISA와 RT-PCR과 비교하였을 때 위양성률이 각각 24%와 31%이었으며 ELISA는 RT-PCR과 비교하였을 때 18%이었다. 마찬가지로 각 검사의 위 음성률을 비교하면 LA는 자체가 위음성률의 비교 기준이 되었으므로 LA의 위음성률을 정할 수는 없었고 RT-PCR은 LA와 ELISA와 비교하였을 때 위음성률이 각각 35%와 25%이었으며 ELISA는 LA와 비교하였을 때 41%이었다. 각 검사별로 보았을 때 위양성률은 RT-PCR과 비교하여 LA는 31%, ELISA는 18%로서 ELISA가 LA보다 우수하였으나 위음성률은 LA와 비교하여 RT-PCR은 35%, ELISA는 41%로서 RT-PCR과 ELISA는 의미 있는 차이를 보이지 않았는데 이러한 차이는 간접적인 특이도의 차이로도 볼 수 있다.
- 이상의 연구 결과를 종합하면 대변에서 로타바이러스 감염 여부를 아는 데 있어 RT-PCR이 ELISA에 비해 탁월하게 우월하다고 생각되지는 않았다. 오히려 RT-PCR을 시행하는 데 드는 많은 시간과 경제적 비용 그리고 숙련된 검사자의 필요성을 고려한다면 임상에서 로타바이러스 감염 여부를 알기 위해 RT-PCR을 사용하기보다는 로타바이러스 감염이 있을 때 역학적 조사의 목적이나 감염 예방을 위한 백신 개발을 위해 로타바이러스의 유전자 typing을 하는 등의 목적으로 사용하는 것이 바람직하다고 생각된다.
- 카파값의 정의에 의하여 RT-PCR과 ELISA 사이에는 중등도의 일치도(Moderate agreement)를 보임을 알 수 있으며 상대적으로 LA는 나머지 두 검사법과의 일치도가 다소 낮음을 알 수 있었다. 이상의 특이도와 카파값에 의한 결과로 면역학적 방법 중 ELISA는 LA보다 대변에서 로타바이러스 감염을 진단하는 데 있어 우월하며 또한 가장 예민한 것으로 알려져 있는 RT-PCR과 특이도의 의미있는 차이없이 상당한 일치를 보임을 알 수 있었다.
- 277이었다. 카파값의 정의에 의하여 RT-PCR과 ELISA 사이에는 중등도의 일치도(Moderate agreement)를 보임을 알 수 있으며 상대적으로 LA는 나머지 두 검사법과의 일치도가 다소 낮음을 알 수 있었다. 이상의 특이도와 카파값에 의한 결과로 면역학적 방법 중 ELISA는 LA보다 대변에서 로타바이러스 감염을 진단하는 데 있어 우월하며 또한 가장 예민한 것으로 알려져 있는 RT-PCR과 특이도의 의미있는 차이없이 상당한 일치를 보임을 알 수 있었다.
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