황복의 소화효소의 변화과정을 부화직후부터 부화 후 65일까지 측정 하였다. 발육단계에 따른 소화효소의 발현과 활성의 변화에서 $\alpha-amylase$ 비활성은 전장 10mm에서 0.0493U/mg의 최소값을 나타낸 후, 전장 19mm를 전후하여 0.1480 U/mg의 최대값을 나타냈다. Trypsin과 pepsin 비활성은 전장 16mm에서 각각 0.0264U/mg, 0.0258U/mg 와 전장 24mm에서 0.0178U/mg, 0.0201 U/mg의 값을 가지는 두 번의 peak를 보였고, 이 시기에 황복 자치어의 성장률도 증가하는 경향을 보였다. 또한, trypsin과 pepsin의 비활성을 비교하여 보면, 자어기인 전장 $4\~5mm$와 치어 II기인 전장 $19\~24mm$에서는 pepsin이 높았고, 치어 I 기인 전장 $11\~16mm$와 유어기인 전장27 mm 이후에서는 trypsin이 높았다.
황복의 소화효소의 변화과정을 부화직후부터 부화 후 65일까지 측정 하였다. 발육단계에 따른 소화효소의 발현과 활성의 변화에서 $\alpha-amylase$ 비활성은 전장 10mm에서 0.0493U/mg의 최소값을 나타낸 후, 전장 19mm를 전후하여 0.1480 U/mg의 최대값을 나타냈다. Trypsin과 pepsin 비활성은 전장 16mm에서 각각 0.0264U/mg, 0.0258U/mg 와 전장 24mm에서 0.0178U/mg, 0.0201 U/mg의 값을 가지는 두 번의 peak를 보였고, 이 시기에 황복 자치어의 성장률도 증가하는 경향을 보였다. 또한, trypsin과 pepsin의 비활성을 비교하여 보면, 자어기인 전장 $4\~5mm$와 치어 II기인 전장 $19\~24mm$에서는 pepsin이 높았고, 치어 I 기인 전장 $11\~16mm$와 유어기인 전장27 mm 이후에서는 trypsin이 높았다.
The digestive enzyme activities such as $\alpha-amylase$, trypsin and pepsin from the laboratory-reared river puffer Takifugu obscurus were measured from the time course of 1 day until the 65 day after hatching. In the case of $\alpha-amylase$, it was showed minimum activity of...
The digestive enzyme activities such as $\alpha-amylase$, trypsin and pepsin from the laboratory-reared river puffer Takifugu obscurus were measured from the time course of 1 day until the 65 day after hatching. In the case of $\alpha-amylase$, it was showed minimum activity of 0.0493 U/mg at the total length (TL) 10 mm, and showed maximum activity of 0.1480 U/mg at 19 mmTL. Trypsin and pepsin were showed their maximum activities of 0.0264, 0.0258 U/mg and 0.0178, 0.0201 U/mg when the total length of 16 and 24 mm, and represented remarkable correlations between the changes of enzyme activity and growth rate. The ontogenetic variations of digestive enzymes were represented clearly different patterns; i.e, the pepsin showed higher activity when the periods of larva ($4\~5\;mmTL$) and juvenile II ($19\~24\;mmTL$), however, the trypsin represented maximum activity at the stages of juvenile I ($11\~16\;mmTL$) and young fish (27 mmTL), respectively.
The digestive enzyme activities such as $\alpha-amylase$, trypsin and pepsin from the laboratory-reared river puffer Takifugu obscurus were measured from the time course of 1 day until the 65 day after hatching. In the case of $\alpha-amylase$, it was showed minimum activity of 0.0493 U/mg at the total length (TL) 10 mm, and showed maximum activity of 0.1480 U/mg at 19 mmTL. Trypsin and pepsin were showed their maximum activities of 0.0264, 0.0258 U/mg and 0.0178, 0.0201 U/mg when the total length of 16 and 24 mm, and represented remarkable correlations between the changes of enzyme activity and growth rate. The ontogenetic variations of digestive enzymes were represented clearly different patterns; i.e, the pepsin showed higher activity when the periods of larva ($4\~5\;mmTL$) and juvenile II ($19\~24\;mmTL$), however, the trypsin represented maximum activity at the stages of juvenile I ($11\~16\;mmTL$) and young fish (27 mmTL), respectively.
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문제 정의
따라서, 본 연구는 담수 생활의 자어기에서 해수 생활의 치어기로 전환하는 황복의 초기 단계에 있어 소화효소의 변화 과정을 규명하고자 한다.
제안 방법
다시 Folin-Ciocalteau's를 넣고 3분이 지난 후, 3분간 5000Xg로 원심분리하여 1시간 후 추출하여 spectrophotometers 700nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosine의 농도를 standard로 하여 각각의 조 효소액의 활성도을 구했으며, 동일 조건의 분석을 4회 반복 측정하였다.
다시 Folin-Ciocalteau's를 넣고 3분이 지난 후, 3분간 5000Xg로 원심분리하여 1시간 후 추출하여 spectrophotometers 700nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosine의 농도를 standard로 하여 각각의 조 효소액의 활성도을 구했으며, 동일 조건의 분석을 4회 반복 측정하였다.
먹이는 부화 후 3일부터 10일까지는 Nannochloropsis sp.fi 배양한 Brachionus rotundiformise, 11일부터 20일까지는 B. rotun- diformis와 Artemia nauplii를 혼합 공급하였고, 21일부터는 200~ 300pm 크기의 배합사료를 성장에 따라 입자의 크기를 조절하여 사육하였다.
소화 효소 분석을 위한 표본은 총 7회에 걸쳐 채집하였다. 분석에 앞서 모든 표본에 대하여 전장 및 체중을 측정하였다. 전장 (TL) 은 자어기에는 해부현미경 하에서 측정하였고, 자어기 이후에는 버어니어 켈리 퍼스로 0.
소화 효소 분석을 위한 표본은 총 7회에 걸쳐 채집하였다. 분석에 앞서 모든 표본에 대하여 전장 및 체중을 측정하였다.
2 mL 첨가하여 100*b의 물에 5분간 방치하였다. 실온에서 30분이 지난 후 spectrophotometer (Model 8452A, Hewlett Packard Diode Array, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였고, standard로 maltose를 사용하였고, 동일 조건의 분석을 4회 반복 측정하였다.
후로 하여 채집하였고, 각각의 단계를 Table 1 에 언급하였다. 실험에 사용한 자치 어는 각각 부화 후 5일, 11일, 35일, 41일, 49일, 56일, 65일인 자치 어이며, 실험에 앞서 각 단계의 표본은 24시간 절식 후, 6시간 간격으로 채집하여 하루 동안의 각 효소 활성의 변화를 측정하였다.
사 육수의 염분 농도는 Park (1999)의 사육 방법을 참고하여, 자치어 의 성장에 따라 부화후 Opsu에서 시작하여 매일 2~3psu씩 염분 농도를 높여주었고 23일 이후부터는 일반해수에서 사육하였다. 자 치어의 관리는 부화 후 23일까지는 Im5 F.R.P. 수조를 사용하여 지수식 조건하에서 매일 50%씩 환수하였고, 23일부터는 3m3 원형 F.R.P. 수조로 옮겨 유수식 조건하에서 사육하였다.
분석에 앞서 모든 표본에 대하여 전장 및 체중을 측정하였다. 전장 (TL) 은 자어기에는 해부현미경 하에서 측정하였고, 자어기 이후에는 버어니어 켈리 퍼스로 0.01 mm 범위까지 측정하였다. 체중은 전자저울을 이용하여 KT1 mg까지 측정하였고, 드라이아이스로 냉동한 후 Deep freezer (Forma, # 0859, USA)에 보관하였다.
균질화된 시료는 20분간 12,000><g으로 원심분리한 후, 상등액을 조 효소액으로 사용하였다. 조 효소액은 0℃의 냉장고에 보관하였고, 24시간 이내에 a-amylase, trypsin 그리고 pepsin의 활성을 측정하였고, 동시에 protein 정량도 측정하였다.
대상 데이터
Dye reagent concentrate를 사용하여 spectrophotometers. 595 nm에서 흡광도를 측정하였고, Standard로는 BSA (Albumin, Bovine)를 사용하였다. 분석은 4회 반복 측정하였다.
실험에 사용한 황복은 1999년 5월 16일 김포 전유리 지선에서 자망에 채포된 친어 (평균 체중 700± 100g, 평균 체장 250±35mm) 에 성선자극호르몬(H.C.G)을 l, 000IU/kg을 주사한 뒤, 24시간 후에 채란하여 수정시켰다. 수정난은 수온 19.
데이터처리
발육 단계에 따른 각 효소의 비활성의 상관관계를 알아보기 위하여 분산분석(ANOVA)을 통하여 유의수준 (p<0.01) 하에서의성을 검증하였고, Duncan test를 이용하여 grouping을 하였다 (SAS, 1987).
이론/모형
Pepsin 활성도 측정은 Meyers and Ahearn (1977)의 방법을 사용하였다. Sodium acetate pH 3.
Trypsin 활성도 측정은 Meyers and Ahearn (1977)의 방법을 사용하였다. Tris-HCl pH 8.
a-amylase의 활성도 측정은 Bemfeld (1951)의 방법을 사용하였다. Buffer로는 sodium phosphate pH 6.
단백질의 측정은 Bradford method (1976)를 사용하였다. Dye reagent concentrate를 사용하여 spectrophotometers.
관리하였다. 사 육수의 염분 농도는 Park (1999)의 사육 방법을 참고하여, 자치어 의 성장에 따라 부화후 Opsu에서 시작하여 매일 2~3psu씩 염분 농도를 높여주었고 23일 이후부터는 일반해수에서 사육하였다. 자 치어의 관리는 부화 후 23일까지는 Im5 F.
성능/효과
이를 Duncan test를 사용하여 Grouping 한 결과는 Table 3-C와 같다. Test의 결과를 보면, pepsin 활성은 stage 1~3, stage 4, stage 5, stage 6 그리고 stage 7에서 각각 차이를 보여주고 있다. 즉, 치어기 이후에는 성장에 따라 활성의 변화가 다름을 나타내고 있다.
Trypsin 비활성을 자치 어의 발육단계에 따라 살펴보면, 자어기인 부화 후 5일 (전장 4.0 mm)부터 증가하기 시작하여 치어기 이후에 2번에 걸쳐 높게 일어나는 것을 보였다 (Fig. 2-A). 첫 번째 peak 는 부화 후 41일 (전장 16.
Trypsin 비활성이 급격히 증가하는 시기를 자치 어의 성장률과 비교하면, 이 시기에 자치 어의 성장률도 높게 나타났다. 이러한 결과는 명태 chalcogrammaa) 에 대한 Oozeki and Baily (1995)의 결과와 일치하는 것으로, 황복도 trypsin 비활성이 급격히 증가하는 시기에 자치 어의 성장률도 높게 나타났다.
황복 자치 어는 발육 단계별로 3 group으로 구별되고, stage 1부터 4, stage 5와 6 그리고 stage 7을 각각 유사한 Group으로 볼 수 있다. 각 발육 단계에서의 주기성을 살펴보면, 전기 자어기인 stage 1부터 치어 II기 초기인 stage 5까지는 24시간 동안의 주기성은 보이지 않으나, 치어 II기 이후로 13시에 a-amylase 활성이 높은 경향을 보이고 있다. 이러한 현상은 황복 치어기에서의 주야 수직 운동과 밀접한 관련이 있는 것으로 사료되나, 인위적인 사육에 따른 효과인지 아니면 황복 자 치어가 자연적으로 지닌 것인지에 관한 것은 추후 연구가 필요하겠다.
1에 나타내었다. 발육단계별 a-amylase의 비활성은 부화 후 5일 (전장 4.0mm)에서부터 35일 (전장 10.78 mm) 사이에는 0.0898 U/mg에서 0.0493U/mg로 완 만하게 감소하는 경향을 보였으나, 부화 후 35일 (전장 10.78 mm) 에서 49일 (전장 19.13 mm) 사이에서는 급격한 증가 추세를 나타냈다 (Fig. 1-A). 이러한 결과는 Baragi and Lovell (1986)의 줄무늬농어 (Morone saxah万s)에 관한 실험에서 유구 소멸의 시기에 amylase 비활성이 감소하는 결과와 일치하는 것으로, 황복도 유 구가 완전히 소멸되는 시기까지 a-amylase 비활성이 감소하는 양 상을 보였다.
0083 U/ larva로 완만하게 증가하고 35일 이후부터 급격히 증가함을 알 수 있다. 이러한 결과를 a-amylase의 변화와 비교하여 보면, a-amy- lase의 단위 개체당 활성의 변화는 장의 분화가 성어와 유사한 부화 후 41일 (전장 16.09mm)에서 급격히 증가하지만, trypsin의 경우는 장에서 분비되는 효소임에도 불구하고 a-amylase와는 달리 부화 후 35일 (전장 10.78 mm)부터 증가했다. 이는 a-amylase의 활성은 장의 분화와 일치하지만, trypsin의 경우는 장의 발달과 더불어 먹이에 의한 영향도 받는다고 사료된다.
stage 1과 2, stage 5와 6에서는 pepsin의 비활성이 높았고, stage 3과 4, stage 7에서는 trypsin의 비활성이 더 높았다. 이를 발육 단계로 보면, 자어기와 치어 II기에서는 pe- psin이 치어 I 기와 유어에서는 trypsin이 더 높은 것으로 나타났다. 또한 유구가 소멸되기 전까지의 발달 양상을 보면 trypsin의 경우는 증가하는 반면 pepsin의 경우는 감소하는 경향을 보인다.
2-B는 trypsin 활성의 변화를 단위 개체당으로 나타낸 것이다. 자어기인 부화 후 5일의 0.0006U/larva에서 35일의 0.0083 U/ larva로 완만하게 증가하고 35일 이후부터 급격히 증가함을 알 수 있다. 이러한 결과를 a-amylase의 변화와 비교하여 보면, a-amy- lase의 단위 개체당 활성의 변화는 장의 분화가 성어와 유사한 부화 후 41일 (전장 16.
田中 (1969)는 감성돔의 pepsin 비활성은 부화 후에는 저하되나 20일 전후부터는 급격히 증가하고 이것은 자어 체내의 위선의 형성기와 일치한다고 하였으며, 이 시기가 해산 rotifer로부터 대형의 동물플랑크톤 또는 사료 전환기라고 추정하였다. 황복 자치 어의 pepsin 비활성의 급 격한 증가는 trypsin 비활성과 같이 부화 후 35일 (전장 10.78 mm) 에서 41일 (전장 16.09 mm), 부화 후 49일 (전장 19.13 mm)에서 56일 (전장 23.59 mm) 구간에서 급격한 증가하는 특징을 보였는데, 이러한 2번의 증가는 위의 연구 결과와 마찬가지로 위선의 발달과 먹이 전환에 따른 것으로 사료된다. 田中 (1975)는 위선의 분화 시 기와 성어에서 볼 수 있는 소화계가 완성되는 시기가 거의 일치 한다고 하였는데, 황복 자치 어의 경우, 두 번의 증가에서 어느 시기에 위선이 형성되는 가는 차후에 조직학적인 연구를 통하여 밝혀내야 하겠지만, Park (1999)의 전장 15mm 전후에 위와 장의 분화가 이루어진다는 연구 결과에 비추어 첫 번째 증가가 위선의 형성과 관련이 있다고 사료된다.
이와 같이, 위가 없는 잉어를 제외하고는 trypsin 활성은 난황이 소비되고 섭이가 시작되는 자어기에서부터 인지가 되었지만 증가하는 형태는 어종에 따라 차이가 있다. 황복의 경우는 자어기부터 인지 되었고 부화 후 35일 (전장 10.78 mm)에서 41일 (전장 16.09 mm), 49일 (전장 19.13 mm)에서 56일 (전장 23.59 mm) 구간에서 급격히 증가하는 특징을 보였다.
후속연구
소화기관이 완전히 분화되기 전인 전기자어기에 발현하는 단백질 분해효소의 역할에 대하여, 川合 (1975)은 부화할 때의 어느 정도의 역할, 즉 부화효소 학적 역할을 한다고 추정하였고, 渡辺 (1985)는 틸라피아나 연어류를 제외하고는 많은 어류에서 부화 후 수십일 동안에 위선의 작용 없이 먹이를 소화흡수 하기 때문에 자 어는 복잡한 고차구조를 가진 단백질을 직장 상피 세포에서 흡수하고, 성어의 소화흡수 기관과는 다르다고 하였다. 그러므로, 황복에 있어서도 전기 자어기의 단백질 분해효소의 난 각에 대한 작용을 연구해야 하고, 소화기관의 분화 이전에 발현되는 단백질 분해효소의 발현에 대하여도 장의 상피세포 등을 통하여 추후 연구할 필요가 있다고 생각된다.
각 발육 단계에서의 주기성을 살펴보면, 전기 자어기인 stage 1부터 치어 II기 초기인 stage 5까지는 24시간 동안의 주기성은 보이지 않으나, 치어 II기 이후로 13시에 a-amylase 활성이 높은 경향을 보이고 있다. 이러한 현상은 황복 치어기에서의 주야 수직 운동과 밀접한 관련이 있는 것으로 사료되나, 인위적인 사육에 따른 효과인지 아니면 황복 자 치어가 자연적으로 지닌 것인지에 관한 것은 추후 연구가 필요하겠다.
이와 같은 각 발육 단계에서의 trypsin과 pepsin의 활성의 비교와 더불어 이들 단백질 분해효소의 역할과 발현 기작에 대하여도 추후의 연구가 요구된다. 소화기관이 완전히 분화되기 전인 전기자어기에 발현하는 단백질 분해효소의 역할에 대하여, 川合 (1975)은 부화할 때의 어느 정도의 역할, 즉 부화효소 학적 역할을 한다고 추정하였고, 渡辺 (1985)는 틸라피아나 연어류를 제외하고는 많은 어류에서 부화 후 수십일 동안에 위선의 작용 없이 먹이를 소화흡수 하기 때문에 자 어는 복잡한 고차구조를 가진 단백질을 직장 상피 세포에서 흡수하고, 성어의 소화흡수 기관과는 다르다고 하였다.
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