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문제 정의
- 넙치의 각종 장기 (뇌, 신장, 간, 근육 등)로부터 얻은 추출물을 가지고 PLD 활성을 조사한 예비실험 결과 신장, 간, 뇌 등의 조직에서 PLD 활성이 관찰되었흐며, 그 중에서도 뇌 조직에서 가장 현저한 PLD 활성이 관찰되었다. 따라서, 본 실험에서는 향후 실험에서 PLD 원료로 사용하기 위하여 넙치의 뇌 조직으로부터 PLD를 부분 정제하였다. 넙치 뇌 조직으로부터 얻은 막 분획물과 세포질 분획물을 Heparin-Sepharose CL-4B conventional 칼럼에 적용한 결과, 세포질 분획물에서는 포스파티딜콜린 (PC) 가수분해작용이 전혀 관찰되지 않았고 막 분획물에서는 NaCl 500 mM 근처에서 한 개의 활성이 있는 부위가 관찰되었다 (data not shown).
- 그러나 연구의 대부분이 포유류에 대하여 이루어지고 있으며 수계생물체에 대한 연구는 거의 전무한 실정이다. 본 연구에서는 넙치 뇌 조직에서 PLD 활성의 특성 규명 및 이 활성을 억제하는 단백질을 분리 정제하여 그 특성을 규명하였다.
- 본 연구에서는 넙치, Paralichthys olivaceus 뇌 조직에서 인지질가수분해효소 D (phospholipase D, PLD)활성의 특성 규명 및 이 활성을 억제하는 단백질을 분리 정제하여 그 특성을 규명하였다. 넙치 뇌 조직에서 PLD 활성이 관찰되었으며, 이 활성은 포스파티딜 이노시톨 비스인산염 (phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate, PIP2)에 대해서 의존성을 나타내었으나, ADP-rebosylation factor (ARF)에 의해서는 영향을 받지 않았다.
제안 방법
- 반응액을 원심분리한 후 지질을 추출하여 chloroform/methanol/conc. HCl(200/100/1)용액에 용해시키고 n-propanol/ammonium hydroxide/water(65/20/15, v/v)의 전개용매를 사용하여 TLC 상에 전개하고 생성된 3H-labeled 생성물들을 autoradiography를 이용하여 확인하였다.
- 넙치 뇌 조직에서 PLD 활성이 관찰되었으며, 이 활성은 포스파티딜 이노시톨 비스인산염 (phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate, PIP2)에 대해서 의존성을 나타내었으나, ADP-rebosylation factor (ARF)에 의해서는 영향을 받지 않았다. PLD 억제물은 넙치 뇌 조직의 세포질 분획물을 사용하여 여러 종류의 칼럼을 통하여 분리 정제하였고, 그 억제물의 분자크기 및 기작의 특성을 규명하였다. 마지막 chromatography을 통하여 여섯 개의 억제를 나타내는 분획물을 얻었으며, 이 중 두 개의 분획물인 ⅡA, ⅡB는 PIP2-phosphatase activities를 나타내었다.
- 5mL 취하여 이 속에 함유된 [3H] choline을 liquid scintilation spectrometry로 측정하였다. PLD 활성 억제 단백질의 활성은 위에서 언급한 PLD 활성 측정 조건하에서 측 정된 PLD 활성을 억제하는 능력으로 판단하였다.
- (1997)의 방법에 따라 포스파티딜콜린 (PC)을 분해하는 능력으로 결정하였다. PLD의 PC 가수분해능력은 16:1.4:1의 molar 비율의 phosphatidylethanol(PE), phosphatidy linositol 4,5-bisphosphate(PIP2), phosphatidylcholine (PC)에 분석당 200,000cpm을 나타내도록 choline-metyl-3H (pam)2PC가 첨가된 인공 인지질막을 기질로 사용하여 다음과 같이 측정하였다. 기질 25 μL를 PLD source, 50 mM HEPES (pH 7.
- Phenyl chromatography로부터 얻은 peak ⅡA (fraction 8~14)을 모아서 buffer E로 하루 동안 투석한 후 원심분리하여 상충액을 얻고, 얻어진 상층액을 미리 buffer E로 평형화된 TSK-gel Heparin-5PW 칼럼에 주입하고 단백질은 1.0 mL/min 속도로 NaCl 농도가 0~1.0 M 되게 60분 동안 linear gradients로 용출하였다. Phenyl chromatography로부터 얻은 peak ⅡB (fraction 39~43)는 buffer E로 하루동안 투석한 후 원심분리하여 상층액을 얻고, 얻어진 상층액을 Microcon-30 (Amicon)을 사용하여 30μL로 농축하여 Pharmacia-LKB SMART System에 장착된 Mono SPC 1.
- Bovine brain phosphatidylcholine (PC) 및 phosphatidylethanolamine(PE)는 Avanti Polar Lipid사로부터 구입하였고, GTPγS 및 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate(PIP2) 및 phosphatidylinositol 4-phosphate (PIP)는 Boehringer Mannheim으로부터 구입하였고, [Choline-methiyl-3H]dipalmitoylphosphtidylcholine (50Ci/mmol), [2-palmitoyl-9,10-3H]dipalmitoylphosphatidylcholine (89 Ci/mmol), [inositol-2-3H]PI(4,5)P2(7 Ci/mmol), [2-3H]inositol 1,4,5 triphosphate (21 Ci/mmol), [2-3H]inositol 1,3,4 triphosphate (21 Ci/mmol) 및 [γ-32P]ATP은 DuPont NEN으로부터 구입하였고, n-octyl-β-D-glucopyranoside는 Calbiochem으로부터 구입하였다. Phosphatidylinositol 4,[32P]5-bisphosphate (PI(4,[32P]5)P2)는 PI(4)P, PIP 5-kinase 및 [γ-32P]ATP 를 반응시켜 만들었다. PIP 5-kinase는 미국 NIH의 Lab.
- , 1994). 그러므로, 본 실험에서 얻은 넙치 뇌 조직의 PC 가수분해 작용이 순수한 PLD에 의한 작용인지 알아보기 위하여 PLD 특유의 반응인 일차 알코올 존재 하에서 포스파티딜에탄올 (phosphatidylethanol, PEtOH) 생성반응 (Kobayashi and Kanfer, 1987; Billah et aL, 1989)을 조사하였다. 일차 알코올이 존재하지 않은 lane 2에서는 phosphatidic acid (PA)만 생성되었고, 일차 알코올이 존재하는 lane 3에서는 PEtOH가 주된 생성물이었다 (Fig.
- , 1997). 따라서, 본 실험에서는 Fig. 3B의 peak ⅡA가 synaptojanin과 관련이 있는지를 확인하기 위하여 peak ⅡA (fraction 8~14)를 Heparin-5PW HPLC 칼럼으로 용출하여 얻은 분획물에 대하여 rat-synaptojanin 다클론항체로 면역 화학적분석을 실시하였다. Fig.
- 35 mL를 넣어 반응을 종결시켰다. 반응액을 원심분리한 후 수용충액을 0.5mL 취하여 이 속에 함유된 [3H] choline을 liquid scintilation spectrometry로 측정하였다. PLD 활성 억제 단백질의 활성은 위에서 언급한 PLD 활성 측정 조건하에서 측 정된 PLD 활성을 억제하는 능력으로 판단하였다.
- 5) buffer로 40μL/min 속도로 단백질을 용출하였다. 얻어진 분획물은 PLD-inhibiting activity assay, SDS-PAGE 등을 사용하여 분석하였다.
- 5), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, leupeptin 및 aprotinin (각각 1μg/mL)]에 현탁하여 같은 조성의 buffer에 하루 동안 투석한 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액을 미리 buffer E로 평형화되어 있는 DEAE-5PW HPLC 칼럼(21.5×150mm)에 주입하고, 칼럼에 부착된 단백질은 처음 70분 동안은 buffer E에 NaCl의 농도가 0~0.3M 범위로 되게 하여 linear gradient 로 5 mL/min 속도로 용출하고, 그 이후에는 100분까지 NaCl 농도가 0.3~1.0M 되게 하여 용출하였다. 이 과정에서 3개의 활성 분획 [peak Ⅰ (fraction 24~32), peak Ⅱ (fraction 58~67), peak Ⅲ (fraction 84~87)]을 얻었다.
- 용해된 막 단백질을 0.3M NaCl이 함유된 buffer B[20mM HEPES (pH 7.0), 1mM EGTA, 0.1 mM DTT, 0.1% Triton X-100]로 평형화된 Heparin-Sepharose CL-6B 칼럼에 주입한 후 칼럼을 완충액으로 세척하고 결합된 단백질은 NaCl 농도가 0.3~2.0 M 되게 하여 linear gradient로 분당 5.0 mL 속도로 용출하였다. 활성을 나타내는 분획물을 모두 모아 buffer B로 4배 희석한 후, buffer B로 미리 평형화되어 있는 TSK gel CM-5PW 양이온 교환 칼럼(7.
- 그러므로, peak ⅡB와 ⅡC에서 얻은 PLD 활성 억제 단백질들은 synaptojanin과는 다른 종류일 것으로 사료되었다. 이들 PLD 활성 억제 단백질들도 포스파타아제 활성 (phosphatase activity)을 가지고 있는지 알아보기 위하여 PI (4,5)P2에 대한 포스파타아제 활성을 조사한 결과, peak ⅡC로부터 얻은 PLD 활성 억제 단백질은 포스파타아제 활성을 나타내지 않았으나 (data not shown), peak ⅡB에서 얻은 단백질은 PI (4,5)P2에 대하여 포스파타아제 활성을 나타내어 대사산물로서 phosphatidylinositol phosphate (PIP)만을 생성하였으며 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol, PI)은 생성하지 않았다 (Fig. 7). 이러한 결과는 peak ⅡB에서 얻은 단백질이 정확한 위치는 알 수 없으나 PI (4,5)P2의 4 혹은 5 위치의 인산 (phosphate) 중 어느 하나를 선택적으로 가수분해시킨다는 것을 암시하였다.
- 3B). 이중에서 PLD 활성 억제 능력이 가장 큰 peak ⅡA (fraction 8~ 14)는 Heparin-5PW HPLC 칼럼으로, peak ⅡB와 peak ⅡC는 각각 Mono-S와 Mono-Q HPLC 칼럼으로 다시 부분 정제하였다. peak ⅡA (fraction 8~14)를 Heparin-5PW HPLC 칼럼으로 용출하였을 때 1개의 활성 지점이 NaCl 농도 약 300mM 근처에서 관찰되었다(Fig.
- 0mL/min 속도로 linear gradient로 용출하였다. 활성을 나타내는 분획물을 buffer D[2OmM HEPES (pH 7.4), 1 mM EGTA, 0.1 mM DTT and 0.7% n-octyl-0-D-glucopyranoside] 로 평형화된 Heparin-5PW 칼럼(7.5×75 mm)에 주입, 세척한 후, 단백질은 1.0mL/min 속도로 60분 동안 NaCl 농도 0~1.0M 범위에서 linear gradient로 용출하였다. 얻어진 활성이 있는 분획물을 PLD 원료로 사용하기 위하여 50μL씩 분주하여 -7℃에 보관하였다.
- 0 mL 속도로 용출하였다. 활성을 나타내는 분획물을 모두 모아 buffer B로 4배 희석한 후, buffer B로 미리 평형화되어 있는 TSK gel CM-5PW 양이온 교환 칼럼(7.5×75 mm, Toso-Haas)에 주입하였다. 단백질은 buffer C[20mM HEPES (pH 7.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 주요한 시약들은 다음과 같다. Bovine brain phosphatidylcholine (PC) 및 phosphatidylethanolamine(PE)는 Avanti Polar Lipid사로부터 구입하였고, GTPγS 및 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate(PIP2) 및 phosphatidylinositol 4-phosphate (PIP)는 Boehringer Mannheim으로부터 구입하였고, [Choline-methiyl-3H]dipalmitoylphosphtidylcholine (50Ci/mmol), [2-palmitoyl-9,10-3H]dipalmitoylphosphatidylcholine (89 Ci/mmol), [inositol-2-3H]PI(4,5)P2(7 Ci/mmol), [2-3H]inositol 1,4,5 triphosphate (21 Ci/mmol), [2-3H]inositol 1,3,4 triphosphate (21 Ci/mmol) 및 [γ-32P]ATP은 DuPont NEN으로부터 구입하였고, n-octyl-β-D-glucopyranoside는 Calbiochem으로부터 구입하였다. Phosphatidylinositol 4,[32P]5-bisphosphate (PI(4,[32P]5)P2)는 PI(4)P, PIP 5-kinase 및 [γ-32P]ATP 를 반응시켜 만들었다.
- 시중에서 구입한 체중 1 kg 넙치의 각종 장기 (뇌, 신장, 간 등)를 적출하여 각각 액체질소로 급속 동결시킨 후 -70℃에 저장하여 필요할 때 시료로 사용하였다.
이론/모형
- Chung et al. (1997)의 방법에 따라 16:1.4:1의 molar 비율의 PE, PI(4,5)P2 및 PC에 분석당 20,000 cpm을 나타나도록 [inositol-2-3H]PI(4,5)P2를 첨가한 인지질 인공막을 기질로 사용하였다. 반응은 3mM Mg2+을 함유한 PLD assay buffer 120μL에 부분 정제된 PLD 억제 분획물 25μL와 기질 25μL를 첨가한 후 37℃에서 10분간 배양하고 PLD 분석에 사용한 반응액에 stop solution A 1 mL과 stop solution B 0.
- PLD 활성은 Chung et al. (1997)의 방법에 따라 포스파티딜콜린 (PC)을 분해하는 능력으로 결정하였다. PLD의 PC 가수분해능력은 16:1.
성능/효과
- 70% ammonium sulfate로 침전시켜 얻은 넙치 뇌 조직의 세포질 단백질 (cytosolic protein)들을 DEAE-5PW HPLC 칼럼으로 용출하여 각각의 분획물들의 PLD 활성 억제 효과를 조사한 결과, PLD 활성 억제는 peak Ⅰ (fraction 24~32), peak Ⅱ (fraction 58~67), peak Ⅲ (fraction 84~87) 3군데에서 관찰되었다 (Fig. 3A). 이 중에서 PLD 활성 억제가 가장 큰 peak Ⅱ (fraction 58~67)를 Phenyl-5PW HPLC 칼럼으로 용출하였을 때 또다시 3개의 활성 부위 (peak ⅡA, fraction 8~14; peak ⅡB, fraction 39~43; peak ⅡC, fraction 54~58)가 관찰되었다 (Fig.
- 5B와 6B에서 얻은 각각의 PLD 활성 억제 분획물들은 rat-synaptojanin 다클론성 항체에 대하여 면역학적 반응을 나타내지 않았다 (data not shown). 그러므로, peak ⅡB와 ⅡC에서 얻은 PLD 활성 억제 단백질들은 synaptojanin과는 다른 종류일 것으로 사료되었다. 이들 PLD 활성 억제 단백질들도 포스파타아제 활성 (phosphatase activity)을 가지고 있는지 알아보기 위하여 PI (4,5)P2에 대한 포스파타아제 활성을 조사한 결과, peak ⅡC로부터 얻은 PLD 활성 억제 단백질은 포스파타아제 활성을 나타내지 않았으나 (data not shown), peak ⅡB에서 얻은 단백질은 PI (4,5)P2에 대하여 포스파타아제 활성을 나타내어 대사산물로서 phosphatidylinositol phosphate (PIP)만을 생성하였으며 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol, PI)은 생성하지 않았다 (Fig.
- 따라서, 본 실험에서는 향후 실험에서 PLD 원료로 사용하기 위하여 넙치의 뇌 조직으로부터 PLD를 부분 정제하였다. 넙치 뇌 조직으로부터 얻은 막 분획물과 세포질 분획물을 Heparin-Sepharose CL-4B conventional 칼럼에 적용한 결과, 세포질 분획물에서는 포스파티딜콜린 (PC) 가수분해작용이 전혀 관찰되지 않았고 막 분획물에서는 NaCl 500 mM 근처에서 한 개의 활성이 있는 부위가 관찰되었다 (data not shown). 이 활성이 있는 막 분획물들을 Heparin-5PW HPLC 칼럼에 적용하였을 때 분획물 38~42사이 (NaCl 농도: 약 700mM 근처)에서 한 개의 활성이 관찰되었다.
- 넙치의 각종 장기 (뇌, 신장, 간, 근육 등)로부터 얻은 추출물을 가지고 PLD 활성을 조사한 예비실험 결과 신장, 간, 뇌 등의 조직에서 PLD 활성이 관찰되었흐며, 그 중에서도 뇌 조직에서 가장 현저한 PLD 활성이 관찰되었다. 따라서, 본 실험에서는 향후 실험에서 PLD 원료로 사용하기 위하여 넙치의 뇌 조직으로부터 PLD를 부분 정제하였다.
- 또한, ⅡB 분획물은 PIP2 phosphatase activity 확인 실험에서 대사산물로서 phosphatidylinositol phosphate(PIP)만을 생성하였다. 이 결과는 ⅡB 분획물이 PIP2의 4 혹은 5 위치의 인산 (phosphate) 중 어느 하나만을 선택적으로 가수분해시킨다는 것을 암시한다. 이상의 연구 결과들을 종합하여 보면, 넙치 뇌 조직에는 다양한 형태의 PIP2-phosphatases가 존재하며, 이들은 PIP2-의존적인 PLD 활성의 억제조절과정에서 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
- 마지막 chromatography을 통하여 여섯 개의 억제를 나타내는 분획물을 얻었으며, 이 중 두 개의 분획물인 ⅡA, ⅡB는 PIP2-phosphatase activities를 나타내었다. 이 중 ⅡA 분획물은 면역화학적 분석을 통하여 inositolpolyphosphate 5-phosphatase family로 알려져 있는 신경말단 단백질인 synaptojanin으로 동정되었다. 그리고 ⅡB faction은 Superose 12 gel filtration chromatography을 통하여 158-kDa의 크기로 확인되었으며, 이것은 면역화학적 분석을 통하여 synaptojanin과는 별개의 단백질로 판명되었다.
- 3A). 이 중에서 PLD 활성 억제가 가장 큰 peak Ⅱ (fraction 58~67)를 Phenyl-5PW HPLC 칼럼으로 용출하였을 때 또다시 3개의 활성 부위 (peak ⅡA, fraction 8~14; peak ⅡB, fraction 39~43; peak ⅡC, fraction 54~58)가 관찰되었다 (Fig. 3B). 이중에서 PLD 활성 억제 능력이 가장 큰 peak ⅡA (fraction 8~ 14)는 Heparin-5PW HPLC 칼럼으로, peak ⅡB와 peak ⅡC는 각각 Mono-S와 Mono-Q HPLC 칼럼으로 다시 부분 정제하였다.
- 7). 이러한 결과는 peak ⅡB에서 얻은 단백질이 정확한 위치는 알 수 없으나 PI (4,5)P2의 4 혹은 5 위치의 인산 (phosphate) 중 어느 하나를 선택적으로 가수분해시킨다는 것을 암시하였다. 한편 synaptojanin은 IP3에 대해서는 5-phosphatase activity를 나타내나 PIP2에 대하여서는 4와 5 위치의 인산염 모두 분해시켜 최종 생성물로서 PI을 생성한다고 알려져 있다 (Chung et al.
- 이상의 결과들을 종합하여 보면 넙치의 뇌 조직에 존재하는 PLD는 포유류의 PLD와는 다른 형태일 가능성이 높은 것으로 사료되며, 또한 이 효소의 활성조절에 여러 종류의 polyphosphoinositide phosphatase들이 관여하는 것으로 사료된다.
- 이 결과는 ⅡB 분획물이 PIP2의 4 혹은 5 위치의 인산 (phosphate) 중 어느 하나만을 선택적으로 가수분해시킨다는 것을 암시한다. 이상의 연구 결과들을 종합하여 보면, 넙치 뇌 조직에는 다양한 형태의 PIP2-phosphatases가 존재하며, 이들은 PIP2-의존적인 PLD 활성의 억제조절과정에서 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
- 한편, Phenyl-5PW HPLC 칼럼으로 얻은 peak ⅡB와 peak ⅡC 를 각각 mono S와 mono Q HPLC 칼럼으로 용출하였을 때 NaCl 농도 약 150mM와 약 400mM 근처에서 각각 1개씩의 PLD 활성 억제 부위가 관찰되었고 (Fig. 5A와 6A), 이들 지점을 각각 gel filtration chromatography로 용출하였을 때 분자량이 약 158 kDa 정도에서 PLD 활성 억제 지점이 관찰되었다 (Fig. 5B와 6B). Fig.
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