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문제 정의
- 이를 극복하기 위해 비면역학적 및 면역학적 유전자 치료를 복합하여 암을 치료할 수 있는지 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 대표적인 약제 감수성 유전자인 herpes simplex virus thymidine kinase(이하 HSTK) 유전자를 이용하여 암세포의 일부를 파괴해서 종양특이항원의 노출을 최대화하고 면역학적 치료로서는 사이토카인 (IL-2, GM-CSF) 유전자를 동시에 이입하여 사이토카인이 분비되고 이 사이토카인에 의해서 많은 면역세포가 암 주위로 몰려들어 결국 암의 종양특이항원을 인지하고 살상할 수 있는 항암면역 반응을 유도하고자 하였다.
- 이를 극복하기 위해 비면역학적 및 면역학적 유전자 치료를 복합하여 암을 치료할 수 있는지 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 대표적인 약제 감수성 유전자인 herpes simplex virus thymidine kinase(이하 HSTK) 유전자를 이용하여 암세포의 일부를 파괴해서 종양특이항원의 노출을 최대화하고 면역학적 치료로서는 사이토카인 (IL-2, GM-CSF) 유전자를 동시에 이입하여 사이토카인이 분비되고 이 사이토카인에 의해서 많은 면역세포가 암 주위로 몰려들어 결국 암의 종양특이항원을 인지하고 살상할 수 있는 항암면역 반응을 유도하고자 하였다.
- 본 연구의 최대 핵심은 HSTK과 사이토카인 유전자 복합 치료법의 종양 치료 효과에 관한 부분이다. 즉 이미 형성된 야생형 LLC의 종양이 유전자로 처리된 LLC, 즉 종양백신의 투여로 치료가 될 수 있는가 하는 점이다.
제안 방법
- 국립암센터 김창민 박사가 제공 한 pMFG-HSTK plasmid를 BamHI로 절단하여 HSTK cDNA를 분리한 후 Qiex kit(Qiagen) 를 이 용하여 순수 분리하였다. 아데노바이러스의 packag ing plasmid 인 pAC CMV pLpA 의 pUC19 poly- linker를 BamHL로 절단한 후 Qiex를 이용해서 순수 분리하였다. HSTK cDNA와 BamHI로 자른 pAC CMV pLpA 를 T4 ligase를 이용하여 16 °C에서 12시간 ligation한 후 E-coli DH5a에 형질전환(trans formation) 을 시행하였다.
- 아데노바이러스의 packag ing plasmid 인 pAC CMV pLpA 의 pUC19 poly- linker를 BamHL로 절단한 후 Qiex를 이용해서 순수 분리하였다. HSTK cDNA와 BamHI로 자른 pAC CMV pLpA 를 T4 ligase를 이용하여 16 °C에서 12시간 ligation한 후 E-coli DH5a에 형질전환(trans formation) 을 시행하였다. Ampicillin을 포함한 LB 배지에서 플라스미드가 이입된 E-coli의 클론을 선택한 후 large scale preparation을 통해 pAC-CMV- HSTK plasmid를 대량 분리하였다.
- HSTK cDNA와 BamHI로 자른 pAC CMV pLpA 를 T4 ligase를 이용하여 16 °C에서 12시간 ligation한 후 E-coli DH5a에 형질전환(trans formation) 을 시행하였다. Ampicillin을 포함한 LB 배지에서 플라스미드가 이입된 E-coli의 클론을 선택한 후 large scale preparation을 통해 pAC-CMV- HSTK plasmid를 대량 분리하였다. 이 플라스미드는 자동염기서열분석기를 이용하여 HSTK 유전자가 정확히 삽입되어 있는지를 확인하였다.
- Ampicillin을 포함한 LB 배지에서 플라스미드가 이입된 E-coli의 클론을 선택한 후 large scale preparation을 통해 pAC-CMV- HSTK plasmid를 대량 분리하였다. 이 플라스미드는 자동염기서열분석기를 이용하여 HSTK 유전자가 정확히 삽입되어 있는지를 확인하였다. 이 pAC CMV pLpAW} adenovirus type 5의 지놈(genome) 전부를 갖고 있는 pJM17을 adenovirus type 5의 El gene이 안정적으로 전달감염 (transfection)되어 있는 293 세포(human renal embryonal cell)에 동시에 인산칼슘침전 방법으로 이입하였다.
- 이 플라스미드는 자동염기서열분석기를 이용하여 HSTK 유전자가 정확히 삽입되어 있는지를 확인하였다. 이 pAC CMV pLpAW} adenovirus type 5의 지놈(genome) 전부를 갖고 있는 pJM17을 adenovirus type 5의 El gene이 안정적으로 전달감염 (transfection)되어 있는 293 세포(human renal embryonal cell)에 동시에 인산칼슘침전 방법으로 이입하였다. 이후 293 세 포를 2% FBS의 RPMI에서 배양하면서 세포병변효과(cytopathic effect)가 생긴 것을 확인한 후 세포를 용해시켜 동종 재조합(homologous recombina tion) 을 통해 만들어진 ad-HSTK를 추출하였다.
- 이 pAC CMV pLpAW} adenovirus type 5의 지놈(genome) 전부를 갖고 있는 pJM17을 adenovirus type 5의 El gene이 안정적으로 전달감염 (transfection)되어 있는 293 세포(human renal embryonal cell)에 동시에 인산칼슘침전 방법으로 이입하였다. 이후 293 세 포를 2% FBS의 RPMI에서 배양하면서 세포병변효과(cytopathic effect)가 생긴 것을 확인한 후 세포를 용해시켜 동종 재조합(homologous recombina tion) 을 통해 만들어진 ad-HSTK를 추출하였다. 이 바이러스는 293 세포(20cm plate, 30개)에서 대량 생산한 후 CsCl 초원심분리를 통해 순수 분리하고 plaque assay를 이용하여 농도를 측정하였다日.
- LLC에 100 moi의 adenovirus-HSTK를 형질도입 (transduction)하고 나서 96 well plate(l x 104/ well)로 옮긴 지 24시간 후 배지를 여러 농도(0, 0.05, 0.5, 5, 50, 500//M)의 GCV를 포함하는 배지로 바꾸고 이후 1일, 3일 5일째에 pink assay를 이용하여 세포수를 측정하였다.
- LLC에 100 moi의 adenovirus-HSTK> 감염시킨 후 아데노바이러스를 처리하지 않은 야생형 (wild type) LLC와 여러 비율로 섞은 다음 6 well plate 에 1.0xl05/well(3배수)씩 올려 놓고 나서 24시간 후에 50小4의 GCV 를 투여하고 그로부터 4일 후 세포 수를 측정하였다가 [00% untransduced LLC의 세포수를 100%로 하여 % survival을 측정하였다.
- LLC에 Ad-HSTK, Ad-IL-2, Ad-GM-CSF 및 Ad -HSTK + Ad-IL-2, Ad-HSTK + Ad-mGM-CSF를 각각 lOOmoi로 감염시킨 후 각 군당 5마리의 C57BL/6 생쥐의 피하 조직에 1.0x1序개씩 주사하고 Ad-HSTK가 감염된 군에는 3-7일까지 GCV (100mg/kg)< 복강 안에 주입하였다. 이후 종양 세포 주사 부위에 종양이 형성되는지를 육안으로 관찰하고 그 크기를 1/2 X (width)2 X (length)의 공식에 따라 측정하였다.
- 0x1序개씩 주사하고 Ad-HSTK가 감염된 군에는 3-7일까지 GCV (100mg/kg)< 복강 안에 주입하였다. 이후 종양 세포 주사 부위에 종양이 형성되는지를 육안으로 관찰하고 그 크기를 1/2 X (width)2 X (length)의 공식에 따라 측정하였다.
- BL/6 생쥐의 우측 배부 피하조직에 주사한 후 7일째 장축이 약 4-5mm 정도 되는 종양이 형성된 것을 확인한 다음 좌측 배부에。>생형 LLC 및 Ad-HSTK, Ad-IL-2, Ad-GM -CSF, Ad-HSTK + Ad-IL-2, Ad-HSTK+Ad- GM-CSF로 감염시킨 LLC를 각각 l.OxlO。개씩 tumor vaccine으로 피하 주사하였다. 그런 다음 3일 째부터 5일간 GCV를 복강 내로 주입하고 나서 우측에 원래 형성되어 있던 종양의 직경의 변화를 관찰하 였다.
- OxlO。개씩 tumor vaccine으로 피하 주사하였다. 그런 다음 3일 째부터 5일간 GCV를 복강 내로 주입하고 나서 우측에 원래 형성되어 있던 종양의 직경의 변화를 관찰하 였다.
- LLC를 Ad-HSTK, Ad-HSTK + Ad-IL-2, 및 Ad -HSTK + Ad-GM-CSF로 형질도입한 후 LOX" 개씩을 피하 조직에 주사하고 나서 3일째부터 5일째 까지 GCV로 처리한 다음 7일째 쥐에서 비장을 적출 하였다. Mouse의 수상세포의 표지자인 CDllc 항체 로 단백면역염색을 시행하여 비장내 CDllc 양성 림 프구, 즉 수상세포의 침윤 정도를 비교하였다.
- LLC를 Ad-HSTK, Ad-HSTK + Ad-IL-2, 및 Ad -HSTK + Ad-GM-CSF로 형질도입한 후 LOX" 개씩을 피하 조직에 주사하고 나서 3일째부터 5일째 까지 GCV로 처리한 다음 7일째 쥐에서 비장을 적출 하였다. Mouse의 수상세포의 표지자인 CDllc 항체 로 단백면역염색을 시행하여 비장내 CDllc 양성 림 프구, 즉 수상세포의 침윤 정도를 비교하였다.
- 위의 결과에서 HSTK, GMCSF의 복합 치료군에서 항암 효과가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 이 효과의 기전을 확인하기 위해 GM-CSF 효과의 특성인 수상세포 (즉 antigen presenting c인I)의 침윤을 비장에서 측정하였다. HSTK 단독 및 HSTK, IL-2 복합 치료 군에서는 CDUc 양성인 수상세포가 거의 관찰되지 않았으나 HSTK, GM-CSF 복합 치료군의 비장에서는 CDllc 양성 수상세포가 많이 관찰되었다(Fig.
- 암세포의 면역 체계 회피 기전 중 종양 특이 항원이 MHC class mole cule, beta-2 microglobulin, TAP 및 B7 등의 결핍 때문에 세포 표면으로 발현되지 않는 것이 중요한 기 전으로 알려져 있다. 본 연구에서는 약제 감수성 유전자인 Herpes simplex thymidine kinase 유전자를 이용하여 암세포를 파괴하므로써 암 세포내의 종양특 이 항원을 세포 외부로 다량 노출시키는 방법을 이용 하였다.
- LLC를 virus의 감염 능력 및 전사 능력을 증강시킨다고 알려진 sodium butyrate(5mM)로 처리하면서 100 moi (multiplicity of infection) 의 아데노바이러스를 1시간 감염시킨 후 butyrate가 포함된 배지에 서 24시간배양하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 세포주는 Lewis lung carcinoma (LLC)로 C57BL/6 생쥐에서 자연적으로 발생한 폐 암 세포주로 미국의 ATCC(Manasas, VA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 동물은 C57BL/6 mouse로 일본의 SLC사에서 구입하였다.
- BL/6 생쥐에서 자연적으로 발생한 폐 암 세포주로 미국의 ATCC(Manasas, VA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 동물은 C57BL/6 mouse로 일본의 SLC사에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 adenovirus-HSTK, adenovirus- mGM-CSF, adenovirus-mIL-2는 모두 본 연구실 에서 제작되었다. 그중 adenovirus-HSTk의 제작 과정은 다음과 같다.
- 그중 adenovirus-HSTk의 제작 과정은 다음과 같다. 국립암센터 김창민 박사가 제공 한 pMFG-HSTK plasmid를 BamHI로 절단하여 HSTK cDNA를 분리한 후 Qiex kit(Qiagen) 를 이 용하여 순수 분리하였다. 아데노바이러스의 packag ing plasmid 인 pAC CMV pLpA 의 pUC19 poly- linker를 BamHL로 절단한 후 Qiex를 이용해서 순수 분리하였다.
- 본 연구에서는 IL-2, GM-CSF 의 두 사이토카인 유전자를 이용하였다. 이 두 유전자가 가장 많이 연구 되어 있고 단독으로도 강력한 항암 면역 반응을 유도한다고 보고되어 있기 때문이다“-".
데이터처리
- 종양의 성장 속도는 여러 군 간의 결과를 two factor factorial ANOVA test로 검증하였다.
성능/효과
- 형질도입이 된 암세포가 5%만 섞인 well에서 40%의 암세포가 죽고 형질도입 암세포가 50% 섞인 well 에서는 85%의 암세포가 죽는 등 현저한 bystander 효과가 관찰되었다(Fig. 2).
- 야생형의 LLC가 종양백신(tumor 같技ecine)으로 사용된 군(대조군)에 비해서 Ad-HSTK 단독, Ad- IL-2 단독 및 AQHSTK+ Ad4L-2 복합으로 이입한 LLC를 종양백신으로 사용한 군에서 LLC 종양의 성장이 부분적으로 억제되었다. (p<0.
- 즉 Ad-HSTK 및 Ad-IL-2의 복합 투여가 단독 투여보다 더 강력한 항암 면역 반응을 유도하지는 않았다. 그러나 Ad-GM-CSF를 이입한 LLC를 주사한 군에서는 대조군 및 Ad-HSTK 군에 비해 종양의 성장이 유의하게 억제되었다(p<0.0i : 대조군, p<0.05 : Ad-HSTK와 비교시). Ad-HSTK 및 Ad-GM- CSF를 동시에 이입한 LLC* 주사한 군에서는 각 바이러스를 단독으로 주사한 생쥐, 특히 Ad-GM-CSF 군에 비해서도 LLC 종양의 성장이 현저하게 억제되었다(p<0, 001) (Fig.
- 05 : Ad-HSTK와 비교시). Ad-HSTK 및 Ad-GM- CSF를 동시에 이입한 LLC* 주사한 군에서는 각 바이러스를 단독으로 주사한 생쥐, 특히 Ad-GM-CSF 군에 비해서도 LLC 종양의 성장이 현저하게 억제되었다(p<0, 001) (Fig. 5).
- 위의 결과에서 HSTK, GMCSF의 복합 치료군에서 항암 효과가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 이 효과의 기전을 확인하기 위해 GM-CSF 효과의 특성인 수상세포 (즉 antigen presenting c인I)의 침윤을 비장에서 측정하였다.
- 이 효과의 기전을 확인하기 위해 GM-CSF 효과의 특성인 수상세포 (즉 antigen presenting c인I)의 침윤을 비장에서 측정하였다. HSTK 단독 및 HSTK, IL-2 복합 치료 군에서는 CDUc 양성인 수상세포가 거의 관찰되지 않았으나 HSTK, GM-CSF 복합 치료군의 비장에서는 CDllc 양성 수상세포가 많이 관찰되었다(Fig. 6).
- . 연구에서 HSTK 유전자가 이입되지 않은 LLC는 성장에 GCV의 영향을 받지 않으나 HSTK 유전자가 이입된 LLC는 GCV에 의하여 강력하게 성장이 억제되는 것 을 볼 수 있었다. 특히 mixed p쟈pulation ouiture를 통해 HSTK gene이 이입된 암세포가 죽으면서 주위 에 있는 HSTK 유전자가 이입되지 않은 LLC도 파괴되는 것을 볼 수 있었다.
- 연구에서 HSTK 유전자가 이입되지 않은 LLC는 성장에 GCV의 영향을 받지 않으나 HSTK 유전자가 이입된 LLC는 GCV에 의하여 강력하게 성장이 억제되는 것 을 볼 수 있었다. 특히 mixed p쟈pulation ouiture를 통해 HSTK gene이 이입된 암세포가 죽으면서 주위 에 있는 HSTK 유전자가 이입되지 않은 LLC도 파괴되는 것을 볼 수 있었다. 이 bystander 효과의 기 전으로는 1.
- ) 죽은 세포의 apoptotic vesi시용이 이웃한 암세포에 의해서 세포내 (endocytosis) 되는 것七 2) 독성 물질이 간극결합(gap junctKm)을 통해서 세포 간에 이동하는 것气 3) 생체 내에서 면역/ 염증반응과 지연형 과민반응을 일으켜서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 것技 등이 있다. 이 bystander 효과는 HSTK 유전자 치료의 가장 중요한 특징으로 알려져 있으며 본 연구에 이용된 adenovirus-HSTK 에서도 생기는 것을 확인할 수 있었다.
- 우선 LLC에 IL-2(LLC-IL-2) 혹은 GM-CSF 유전자(LLC-GM-CSF) 만을 이입한 후 쥐에 주사하여 종양을 형성하는가를 본 실험의 결과로서 IL-2 를 이입한 LLC는 종양을 형성하지 못하였지만 GM- CSF를 이입한 쥐에서 종양이 형성되었다. 그러나 Ad-HSTK 단독, Ad-HSTK+Ad-IL-2, Ad- HSTK + Ad-GM-CSF 복합 이입 후 쥐에 주사한 다 음 GCV를 처리한 경우 초기에 작은 종양이 형성되다가 소실되어 종양백신으로 사용할 수 있음을 확인하였 다.
- 우선 LLC에 IL-2(LLC-IL-2) 혹은 GM-CSF 유전자(LLC-GM-CSF) 만을 이입한 후 쥐에 주사하여 종양을 형성하는가를 본 실험의 결과로서 IL-2 를 이입한 LLC는 종양을 형성하지 못하였지만 GM- CSF를 이입한 쥐에서 종양이 형성되었다. 그러나 Ad-HSTK 단독, Ad-HSTK+Ad-IL-2, Ad- HSTK + Ad-GM-CSF 복합 이입 후 쥐에 주사한 다 음 GCV를 처리한 경우 초기에 작은 종양이 형성되다가 소실되어 종양백신으로 사용할 수 있음을 확인하였 다.
- 4). 그러나 GM-CSF의 경우에서는 LLC-GM -CSF로 치료한 군에서 대조군에 비해 현저한(p<0. 01) 성장 억제 효과를 보였고 LLC-HSTK 치료군에 비해서도 유의한 성장 억제를 보였다(p<0.05). 특히 LLC-HSTK-GM-CSF를 주사한 군에서 단독 치료 군들에 비해서 더 강력한 성장 억제 효과가 일어나는 것을 관찰하여 기대했던 대로 항암 효과가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 05). 특히 LLC-HSTK-GM-CSF를 주사한 군에서 단독 치료 군들에 비해서 더 강력한 성장 억제 효과가 일어나는 것을 관찰하여 기대했던 대로 항암 효과가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).
- 본 연구에서는 HSTK과 IL-2의 복합 치료에서는 단독 치료에 비해 항암 효과가 더 커지지 않고 HSTK와 GM-CSF의 복합이 항암 효과를 증강시킨다는 결과를 얻었다. 특히 Ad-GM-CSF로 치료한 생쥐의 비징에서 항원표현 (antigen presentation) 기능이 있는 CDllc 양성 수지세포가 현저하게 증가 하는 것이 관찰되어 이미 알려져 있는 GM-CSF에 의한 수지세포로의 분화 촉진购-a이 일어나고 있어 중요 기전이 되리라는 간접적인 증거를 얻었다.
- 본 연구에서는 HSTK과 IL-2의 복합 치료에서는 단독 치료에 비해 항암 효과가 더 커지지 않고 HSTK와 GM-CSF의 복합이 항암 효과를 증강시킨다는 결과를 얻었다. 특히 Ad-GM-CSF로 치료한 생쥐의 비징에서 항원표현 (antigen presentation) 기능이 있는 CDllc 양성 수지세포가 현저하게 증가 하는 것이 관찰되어 이미 알려져 있는 GM-CSF에 의한 수지세포로의 분화 촉진购-a이 일어나고 있어 중요 기전이 되리라는 간접적인 증거를 얻었다.
- 결론적으■로 Herpes simplex virus thymidine ki- nase를 이입하는 비면역적 유전자 치료와 GM-CSF 등의 사이토카인을 이입하는 면역적 유전자 치료를 복합하므로써 암을 치료할 수 있는 가능성을 제시하였 다.
후속연구
- 그러나 HSTK와 GM-CSF의 복합으로 항암 효과 의 증가를 관찰하기는 하였으나 종양의 완전 소실을 얻지는 못한 만큼 향후 다른 사이토카인 등과의 3제 복합 유전자요법 등의 연구가 필요하리라 본다.
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