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문제 정의
- 특히, 최근에 생약이나 한약재 같은 천연물을 이용하여 멜라닌색소와 관련된 연구가 매우 활발하게 진행되고 있다.26-29) 본 연구팀은 피부질환 치료제 및 미백제 개발의 일환으로, 야채, 과일, 콩과 식물에 널리 함유되어 있는 quercetin이 멜라닌생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16 melanoma 세포를 이용하여 그 결과를 이미 얻었다.30) 그러나 melanoma 세포와 정상적인 melanocyte 사이에 일부 신호기전이 다를 수 있으므로 quercetin이 melano-cyte에서도 동일한 영향을 끼치는지 알아보는 것이 필수적이다.
- 1)는 한 쌍의 구리이온 (Cu2+)을 함유하고 있는 금속단백질군(metalloprotein)에 속하며, monophenol의 ortho hydroxylation(cresoase activity) 과 catechols의 0-quinone으로의 산화(catecholase activity)의 두가지 반응을 촉매하여 최종적으로는 멜라닌 고분자를 합성하는데 작용하는 것으로 알려져 있다.35) 본 연구에서는 quercetin0] Melan-a melanocyte 세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 세포에 quercetin을 0.1-40㎍/ml의 여러 농도별로 처리하고 48시간 배양한 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. Fig.
- 30) 그러나 melanoma 세포와 정상적인 melanocyte 사이에 일부 신호기전이 다를 수 있으므로 quercetin이 melano-cyte에서도 동일한 영향을 끼치는지 알아보는 것이 필수적이다. 따라서, 본 연구에서는 Melan-a 정상세포에 quercetin 을 처리하고 세포의 증식과 tyrosinase 활성 및 melanin 양을 측정한 결과 유의한 효과를 보았기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 34)그러므로 quercetin에 노출된 Melan-a melanocyte 세포의 증식이 감소한 이유가 세포사멸에 기인하는 것인지를 알아보기 위하여, Melan-a melanocyte 세포에 quercetin을 0.1-30㎍/ml의 여러 농도별로 처리하고 48시간이 지난 후에 위상차 현미경으로 실험군 세포의 형태학적 변화를 대조군과 비교하여 관찰하였다. Fig.
- 1)의 효소반응으 로 합성되는 페놀류의 생물 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다.36-38)Quercetin이 in vitro 상태에서 멜라닌 합성에 미치는 영향을 직접 확인하기 위하여 Melan-a melanocyte 세포에 quercetin을 0.01-30 ㎍의 다양한 농도로 처리하고 48시간 세포를 배양한 다음 최종산물인 멜라닌 생성을 측정하였다. Fig.
- MTT Assay - MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-gl)-2, 5- diphenyltetrazolium bromide) 정 량은 Mosmann의 방법31)을 변형하여 실시하였다. Quercetin을 세포에 투여하여 48시간 동안 배양한 후 상층액을 버리고 당일 제조한 500㎍/ml MTT를 배양 용기당 1 ml씩 넣어 은박지로 포장한 후 3시간 동안 배양하였다.
- 1). Quercetin이 쥐의 정상적인 melanocyte인 Melan-a 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 quercetin을 0.01 ㎍/ml에서 60㎍/ml까지 다양한 농도로 처리하고, 세포를 48시간 동안 배양한 후 MTT 측정방법으로 세포의 증식을 관찰하였다. Fig.
- Quercetin이 피부의 멜라닌 색소 형성에 어떠한 영향을 나타내는지를 연구하기 위하여 , Melan-a melanocyte 세포에 quercetin을 다양한 농도로 처리한 후 세포의 증식, 형태적 변화, tyrosinase 활성도 및 멜라닌 양의 변화를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Quercetin이 5.
- Trypan blue 검사 - 대조군과 실험군의 각 well에 0.05% trypsin- 0.02% ED1A 용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리 수거하였다. 이 분리 수거한 세포를 phosphate-buffered saHne(PBS)로 2회 세척한 후 시료 0.
- 검액조제 - Quercetin (Sigma Chemical Co., USA)을 에탄올에 녹여 0.22 ㎛ pore 여과지로 여과 멸균한 후 stock solution을 만들었으며, 실험에 이용하기 직전 실험농도에 알맞게 RPMI 1640 배지로 희석하여 농도를 조정한 다음 사용하였다.
- 살아 있는 세포는 MTT와 반응하여 보라색 불용성 formazan 침전물이 형성되며 이것을 용해시키기 위하여 상층액을 버리고 10% DMSO를 200㎕씩 넣고 15분간 실온에서 방치하였다. 그 후 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 10% DMSO가 첨가된 IN NaOH 용액을 200)11 첨가하고 80℃에서 1시간 동안 용해하였으며, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌 (Sigma Co.)을 사용하여 작성된 표준직선에서 구하고, 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.
- 멜라닌 양의 측정 - 멜라닌 양은 Hosoi32)등의 방법을 변형하여 사용하였다. 세포를 배양하여 PBS로 2회 세척한 후 원심분리하여 세포 침전물을 만들었다.
- 4% (w/v) trypan blue를 잘 섞은 다음 혈구 계산판을 이용하여 trypan blue에 염색되지 않은 살아 있는 세포 수를 계수하였다. 실험군의 세포 수는 대조군의 세포 수에 대한 백분율로 5회 반복 실험하여 계산하였다.
- 02% ED1A 용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리 수거하였다. 이 분리 수거한 세포를 phosphate-buffered saHne(PBS)로 2회 세척한 후 시료 0.02ml와 동량의 0.4% (w/v) trypan blue를 잘 섞은 다음 혈구 계산판을 이용하여 trypan blue에 염색되지 않은 살아 있는 세포 수를 계수하였다. 실험군의 세포 수는 대조군의 세포 수에 대한 백분율로 5회 반복 실험하여 계산하였다.
- 형태학적 변화 - Melan-a 세포를 각 well당 1×105, 개씩 넣고 24시간 경과 후 quercetin을 농도별로 첨가하여 48시간 동안 배양한 다음 위상차 현미경 (Diaphot 300, Nikon, Japan)을 이용하여 100배율 하에서 대조군과 실험군의 형태학적 변화를 관찰, 비교하였다.
데이터처리
- 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's f-test를 이용하였다.
- 통계방법 - 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's f-test를 이용하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 활성도의 측정 - - Tyrosinase 활성도는 MatinezEsparza33) 방법에 의하여 측정하였다. 각 well의 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 만들고, 100㎕의 lysis buffer (1% Triton X-100, 10 mM sodium phosphate, 0.
성능/효과
- 39) 본 연구의 결과를 종합해 볼 때, Melan-a melanocyte 세포에 quercetin을 처리하였을 때 1.0 ㎍/ml 농도까지는 세포의 유의한 증식이 없으면서 대조군에 비하여 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생성이 모두 증가하는 경향을 보였고 그 이후의 처리 농도에서는 두 가지 모두 감소함을 보여주었다. 이러한 점에 비추어 볼 때 quercetin이 처리된 Melan-a melanocyte 세포의 멜라닌화는 세포의 증식과 관련 있는 것이 아니라, tyrosinase 활성도의 증가로 인해 촉진되는 것으로 해석할 수 있다.
- 1-40㎍/ml의 여러 농도별로 처리하고 48시간 배양한 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 quercetin 처리 농도가 까지는 투여 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성도는 대조군에 비하여 점점 증가하였으며 그 증가 비율 또한 모두 유의성이 있음을 보여주었다. 그러나 처리 농도가 5 ㎍/ml 이상에서는 투여 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성도는 점점 감소하는 경향을 보였고 이것은 B16/F10 melanoma 세포에서와 비슷한 양상을 보였다.
- 같은 결과를 얻었다. Quercetin이 5.0 ㎍/ml 농도까지는 세포가 약간 증가하였으나 유의할 만한 차이는 없었으며, 10㎍/ml 농도 이상에서는 유의성 있게 세포 증식이 억제되고 세포분화는 촉진되었다. Tyrosinase 활성도는 1.
- . 결론적으로 저농도의 quercetin 처리는 B16/F10 melanoma 와 Melan-a melanocyte 세포 모두 세포의 증식에는 유의할 만한 변화 없이 멜라닌화를 촉진시키며 고농도에서는 세포의 증식을 억제하면서 멜라닌화도 억제시킨다.
- 0㎍/ml 이하의 낮은 농도에서는 대조군에 비해 약간 증가하였으나 유의할 만한 변화를 나타내지 않았다. 그러나 10㎍/ml 농도부터는 대조군에 비해 세포의 증식이 서서히 억제되는 경향을 보였으며 계속적으로 60 jig/ml 농도까지 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 증식이 유의성 있게 억제되는 경향을 보여주었다. 또 다른 실험 방법으로서 quercetin을 0.
- 0㎍/ml의 낮은 농도에서는 대조군과 비교하여 실험군에서 세포밀도가 약간 증가하거나 변화가 없는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 그 이상의 처리농도에서는 농도 의존적으로 대조군에 비하여 실험군에서의 세포 밀도는 점차 감소하였으며 오히려 세포의 크기는 약간 커졌고 또한 수지상 돌기의 형태가 나타나면서 길이가 약간 길어짐을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 높은 농도의 quercetin이 Melan-a 세포의 성장을 억제함으로서 세포 증식을 억제시키고 세포의 분화를 촉진하는 것을 보여준다.
- 그러나 10㎍/ml 농도부터는 대조군에 비해 세포의 증식이 서서히 억제되는 경향을 보였으며 계속적으로 60 jig/ml 농도까지 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 증식이 유의성 있게 억제되는 경향을 보여주었다. 또 다른 실험 방법으로서 quercetin을 0.01㎍/ml에서 60 ㎍/ml까지 다양한 농도로 처리하고, 세포를 48시간 동안 배양한 후 trypan blue 용액을 이용하여 염색되지 않은 살아 있는 세포 수를 조사해 본 결과 MTT측정의 결과와 마찬가지로 5 ㎍/ml 이상의 투여 농도에서 세포 수가 농도에 의존적으로 유의성 있게 감소하는 경향을 보여주었다(Fig. 3). 이상의 결과를 종합해 볼 때 quercetin은 5 ㎍/ml 이상의 투여 농도에서 Melan-a melanocyte 세포의 증식과 성장을 억제시킴을 알 수 있었다.
- 0 ㎍/ ml 농도까지는 농도 의존적으로 tyrosinase 활성도가 증가되었고, 그 이상의 농도에서는 tyrosinase 활성도가 오히려 감소하였다. 멜라닌 생성은 tyrosinase 활성도와 마찬가지로 1.0㎍/ml까지는 증가되었고, 특히 10㎍/ml 처리군에서는 대조군보다 130%의 증가를 보였다. 그 이상의 농도에서는 멜라닌 생성이 오히려 유의성 있게 감소하였다 이러한 양상은 B16/F10 melanoma 세포의 결과와 거의 같았다.
- 이러한 점에 비추어 볼 때 quercetin이 처리된 Melan-a melanocyte 세포의 멜라닌화는 세포의 증식과 관련 있는 것이 아니라, tyrosinase 활성도의 증가로 인해 촉진되는 것으로 해석할 수 있다. 반면에 5 ㎍/ml 이상의 농도로 quercetin을 처리한 세포들은 세포의 사멸이 초래되지 않으면서 세포 증식이 억제되는 현상과 더불어 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생성 모두가 대조군에 비하여 오히려 감소하는 경향을 보여주었다. 이것은 Melan-a melanocyte 세포와 B16/F10 melanoma 세포 모두에 같은 양상으로, 높은 농도의 quercetin을 처리하게 되면 세포의 성장이 억제되면서 세포분화가 유도되고 tyrosinase 활성도를 감소시키므로 최종산물인 멜라닌의 합성이 감소, 억제되는 것으로 사료된다.
- 그러나 10㎍/ml 이상에서는 처리농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성이 감소되는 경향을 보였으며 통계학적으로 유의성이 있음을 보여주며 B16/F10 melanoma 세포에서도 거의 유사한 경향을 보인다. 이러한 결과는 quercetin에 노출된 Melan-a melanocyte 세포의 in vitro tyrosinase 활성도 변화와 매우 잘 일치함을 보여준다.
- 그러나 그 이상의 처리농도에서는 농도 의존적으로 대조군에 비하여 실험군에서의 세포 밀도는 점차 감소하였으며 오히려 세포의 크기는 약간 커졌고 또한 수지상 돌기의 형태가 나타나면서 길이가 약간 길어짐을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 높은 농도의 quercetin이 Melan-a 세포의 성장을 억제함으로서 세포 증식을 억제시키고 세포의 분화를 촉진하는 것을 보여준다. 그러나 세포사멸의 특징인 세포막 외부 융기의 돌출 현상과 배양배지 속에 세포사멸이 유도된 부유세포도 관찰 할 수 없었다.
- 3). 이상의 결과를 종합해 볼 때 quercetin은 5 ㎍/ml 이상의 투여 농도에서 Melan-a melanocyte 세포의 증식과 성장을 억제시킴을 알 수 있었다. 대조군에 비하여 실험군의 세포 수가 줄어드는 현상은 외부 자극물질의 세포독성에 의한 세포사멸로 인한 생존 세포수가 감소하는 경향과 여러 가지 신호기전을 통한 세포분열의 일시적인 정지로 세포 증식이 감소하는 경향으로 나누어 고려해 볼 수 있다.
후속연구
- 즉, quercetin은 고농도에서 Melan-a 세포의 성장을 억제시키지만 세포사멸을 유도하지는 않는 것으로 보인다. 세포의 성장이 정지되는 시기로는 크게 2가지 즉 G1 checkpoint와 G2 checkpoints 구분할 수 있으며 quercetin 에 노출된 Melan-a 세포의 경우에 어느 시기에 해당하는지는 DNA 농도를 결정함으로서 차후 결정할 수 있을 것으로 사료된다.
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