[논문]Quercetin이 B16/F10 멜라닌세포의 중식 및 멜라닌화에 미치는 영향

천현자; 백승화; 우원홍; 황상구; 김춘관; 김춘관

문제 정의

그 기능은 멜라노좀내에서 tyrosine을 산화시켜 dopa를 만드는 tyrosine hydr成ase 와, dopa를 산화시켜 dopachrome을 만드는 dopa oxidase로 작용하여 최종적으로는 melanin polymer를 합성하는데 작용하는 것으로 알려져 있다.28)그러므로 본 연구는 quercetin이 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 세포에 quercetin을 0.1—40 |Xg/m/의 여러 농도별로 처리호]" 고 48시간 배양한 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. Fig.
있다.22%):Z러므로 본 연구는 피부질환 치료제 비 미백제 새발의 일환으로, 양파와 같은 Allium속 채소류에 다량 함유되어있는 flavonols구조인 quercetin이 멜라닌생성에 미시는 영향은알아보기 위하여 B16/F10 melanoma 세포에 quercetin을 처리하고 세포의 증식과 멜라닌화에 미치는 영향을 조사하였다.

가설 설정

!i과»에 관한 것들이 있다. :Z러나 T라닌세포의 멜라닌화외 나련한 인子 는 지금까지 보고된 바 없다.

제안 방법

그리고 dopaquinone은 상대적으로 불안정한 중간매체인 dopachrome으로 전환된 후 5, 6-di诅ydroxyindole을 거尤 멜라닌 고분자를 형성하는 것으로 알려져 있디.%)Quercetin이 in vitro 상태에서 멜라닌 합성에 미치는 영향을 직접 확인하기 우하여 최종산물인 멜라닌 양을 측정하였다. B13/F10 melanoma 세포에 quercetin을 1—50 jig/m/의 다양한 농도로 처리하고 48 시간 세포를 배양한 다음 멜라닌 생성을 측정하였다.
%)Quercetin이 in vitro 상태에서 멜라닌 합성에 미치는 영향을 직접 확인하기 우하여 최종산물인 멜라닌 양을 측정하였다. B13/F10 melanoma 세포에 quercetin을 1—50 jig/m/의 다양한 농도로 처리하고 48 시간 세포를 배양한 다음 멜라닌 생성을 측정하였다. Fig.
MTT Assay - MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-gl)-2, 5-diphenyl - tetrazolium bromide) 정량은 Mosmann의 방법囲을 변헝하여 신시하였다. Quercetin음 세¥에 투여하여 48 시간 동안 배양한 후상층액을 버리고 당일 제조한 500 yLg/ml MTT를 비양 용기당 1 m/씨 넣어 은박지로 포장한 후 3 시간 동안 배양하였다.
1). Quercetin이 B16/F10 melanoma 세노의 言시에 田치는 영향을 알3}보기 위하여 quercetin을' 0.01 阐 mZ에서 100 까지 다양한 농曰: 4리하고, 세포를 48 시간농안 배양한 후 MTT측정방법-Q로 세 正의 중시을 관찰하였다. Fig.
Quercetin이 피부의 멜라닌 색소 형성에 어떠한 영향을 나타내는지를 규명하기 위하여, B16/F10 melanoma 세포에 여러 가지 농도의 quercetin을 처리한 후 세포의 증식, 형태적 변화, tyrosinase 활성도 및 멜라닌 양의 변화를 측정하여 다음과 같은결과를 얻었다.
세포의 형태학적 변화-Quercetin에 노출된 B16/F10 melanoma 세포의 증식이 감소한 이유가 세포사멸에 기인하는것인지를 알아보기 위하여, B16/F10 melanoma 세포에 quercetin 을 5-30 卩g/mZ의 여러 농도별로 48시간 처리하고 그 후에 형태학적 변화를 confocal 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 5의 낮은 농도의 처리군에서는 대조군과 비교하여 세포모양과 수에 큰 변화를 관찰할 수 없었으나, 처리 농도가 높아질수록 세포의 밀도는 대조군에 비해 점차 감소하였으며 세포의 크기는 다소 커졌고 수지상 돌기의 형태가 나타나면서 길이가 약간 길어짐을 관찰할 수 있었다(Fig.
있느 세포 수를 계수하였다. 신험군의 세포 수는 대조군의 세포 수에 대한 백분율로 5회 반복 실험히⑴ 계산하였다.
4%(w/v) trypan blue를 즈! 섞은 다으 혈:产 게산판을 이용하어 ttypan blue 에 염색되지 않은 실■아. 있느 세포 수를 계수하였다. 신험군의 세포 수는 대조군의 세포 수에 대한 백분율로 5회 반복 실험히⑴ 계산하였다.

대상 데이터

Co.)°l 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 배지에 penicillin-streptomycin (Sigma Chemical Co.

데이터처리

대소군에 대한 백분율로 나다나었다. 각 군간으 동계적유의성에 대한 검증3 Student's t-test 이용하였다.
통계방법 - 실험결과는 평균二표준편자로 표시하였으며, 각 실 힘 군은 대소군에 대한 백분율로 나다나었다. 각 군간으 동계적유의성에 대한 검증3 Student's t-test 이용하였다.

이론/모형

Tyrosinase 활성도의 측정 - Tyros nase 활성도는 Matinez- Esparza27, °] 방법에 의하여 측정하였다. 각 well의 세포를 원심분리하여 세포 침전믈은 만들고, 100 岬] lysis buffer(l% Triton X-100, 10 mM sodium phosphate, 0/ mM PMSE pH 7.

성능/효과

1. Quercetin이 20 jig/m/ 농도까지는 세포증식에 유의한 차이는 없었으나, 20 gg/rn/ 농도 이상에서는 유의성있게 세포증식이 억 제되 었으며 , 세포분화는 촉진되 었다.
2. Tyrosinase 활성도는 10 gg/mZ 농도까지는 농도 의존적으로 tyrosinase 활성도가 증가되었고 그 이상의 농도에서는 tyrosinase 활성도가 오히려 감소하였다.
3. 멜라닌 생성은 tyrosinase 활성도와 마찬가지로 10 Mg/mZ까지는 증가되었고, 특히 , 10 ng/m/ 처리군에서는 대조군보다 130% 의 증가를 보였다. 그 이상의 농도에서는 멜라닌 생성이 오히려 감소하였다.
증가 등에 의해서 이루어진다고 알려져 있다.3°)본 연구의 결과를 종합해 볼 때, B16/F10 melanoma 세포에 quercetin을 처리하였을 때 10 卩血 농도까지는 세포의 유의한 증식이 없으면서 대조군에 비하여 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생성이 모두 증가하는 경향을 보였고 그 이후의 처리 농도에서는 세포분화의 촉진과 더불어 두 가지 모두 감소함을 보여주었다. 이러한 점에 비추어 볼 때 quercetin이 처리된 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 화는 세포의 증식과 관련 있는 것이 아니라, tyrosinase 활성도의 증가로 인해 촉진되는 것으로 해석할 수 있다.
1—40 |Xg/m/의 여러 농도별로 처리호]" 고 48시간 배양한 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 quercetin 처리 농도가 10 卩g/mZ까지는 투여농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성도는 대조군에 비하여 점점 증가하였으며 그 증가 비율 또한 모두 유의성이 있음을 보여주었다. 특히, 10 lig/ml 투여군에서는 대조군에 비해 약 1.
결론적으로 저농도의 quercetin 처리는 세포의 증식에는 유의할 만한 변화 없이 멜라닌화를 촉진시키며, 고농도에서는 세포의 증식을 억제하면서 멜라닌화도 억제시킨다. 따라서 quercetin 의 사용농도에 따른 畛경로의 연구를 통하여 사용목적에 맞는기준량을 설정하여 멜라닌 색소와 관련된 미백제 및 색소성 질병의 치료에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
변화를 confocal 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 5의 낮은 농도의 처리군에서는 대조군과 비교하여 세포모양과 수에 큰 변화를 관찰할 수 없었으나, 처리 농도가 높아질수록 세포의 밀도는 대조군에 비해 점차 감소하였으며 세포의 크기는 다소 커졌고 수지상 돌기의 형태가 나타나면서 길이가 약간 길어짐을 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 결과는 높은 농도의 quercetin0] B16/F10 melanoma 세포의 성장을 억제함으로서 세포증식을 억제시키고 세포의 분화를 촉진하는 것을 보여준다.
이러한 현상은 100 卩以m2 농도까지 지속됨을 보여주었다. 또 다른 실험 방법으로서 trypan blue 용액에 염색되지 않은 살아 있는 세포 수를 조사해본 결과 5 LLg/ml 이상의 투여 농도에서 세포 수가 농도에 의존적으로 점점 유의성 있게 감소하는 경향을 보여주었다(Fig. 3). 이 결과는 MTT를 이용한 세포증식의 결과와 유사한 경향을 보여 주었고, 다소 저농도의 처리 군에서 MTT측정 결과와 비교하여 세포증식의 감소현상이 더욱 크게 나타난 것은 실험 방법상의 차이점에 기인한 것으로 보인다.
3). 이 결과는 MTT를 이용한 세포증식의 결과와 유사한 경향을 보여 주었고, 다소 저농도의 처리 군에서 MTT측정 결과와 비교하여 세포증식의 감소현상이 더욱 크게 나타난 것은 실험 방법상의 차이점에 기인한 것으로 보인다. 이상의 결고}를 종합해 볼 때 quercetin은 B16/F10 melanoma 세포의 증식을 억제시킴을 알 수 있었다.
그러나 20이상에서는 처巴농도가 증가함에 따라 멜라닌 생성이 감소되는 경향을 보였으b 감소 비율 또한 통계학적으로 유의성이 있음을 보여주었다. 이러한 결과는 quercetin에 노출된 B16/F10 melanoma 세포의 in vitm tyrosinase 활성도 변화와 매우 잘 일치함을 보여준다.
4). 이러한 결과는 높은 농도의 quercetin0] B16/F10 melanoma 세포의 성장을 억제함으로서 세포증식을 억제시키고 세포의 분화를 촉진하는 것을 보여준다. 그러나 세포사멸의 특징인 세포막 외부 융기의 돌출현상은 관찰할 수 없었고 배양배지 속에 세포사멸이 유도된 부유세포도 또한 관찰할 수 없었다.
이 결과는 MTT를 이용한 세포증식의 결과와 유사한 경향을 보여 주었고, 다소 저농도의 처리 군에서 MTT측정 결과와 비교하여 세포증식의 감소현상이 더욱 크게 나타난 것은 실험 방법상의 차이점에 기인한 것으로 보인다. 이상의 결고}를 종합해 볼 때 quercetin은 B16/F10 melanoma 세포의 증식을 억제시킴을 알 수 있었다. 대조군에 비하여 실험군의 세포수가 줄어드는 현상은 세포사멸로 인한 세포수의 감소와 세포분열의 정지로 인한 세포 증식의 감소로 나누어 고려해 볼 수 있다.

후속연구

증식을 억제하면서 멜라닌화도 억제시킨다. 따라서 quercetin 의 사용농도에 따른 畛경로의 연구를 통하여 사용목적에 맞는기준량을 설정하여 멜라닌 색소와 관련된 미백제 및 색소성 질병의 치료에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

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