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문제 정의
- 대한약전 및 대한약전외 한약 규격 주해에는 부자 정량법이 적 정법으로 수재 되 어 있고4)부자류 한약재의 성분 중 aconitine계 알칼로이드의 분석방법 및 함량의 비교분석 방법 등에 관하여 보고되었으나 수치 방법에 따른 함량의 비교분석 방법은 보고되어 있지 않아 본 연구에서는 표준품을 설정하고 수치 방법에 따른 성분의 함량을 비교 분석하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 시약과 용매는 특급 또는 1급 시약을 사용하였으며, HPLC 용 용매는 HPLC grade (Fisher)를 사용하였다. Aconitine은 Sigma Chem.
- 수치 - 중약대사전13) 및 포제법14)에 일반적으로 알려져 있는 방법과 마이크로파 처리하여 단 시간에 수치 할 수 있는 방법으로 연구 보고된 문헌15)에 근거하여 수치하였다.
- 표준액의 조제 - Mesaconitine, aconitine 및 hypaconitine 각각 2.0 mg을 HPLC용 CH3CN 10 ml에 녹이고 이것을 stock solution으로 하여 20, 50, 100, 150, 200㎍/ml로 단계적으로 희석하여 검량용 표준용액으로 하였다. 각각의 표준용액 10μl를 HPLC로 분석하여 chromatogram의 면적을 구하고 이들의 면적과 표준용액의 농도를 변수로 한 검량선을 작성하여 얻은 회귀직선 방정식은 다음과 같다.
- 검액의 조제 - 검체 각각 10.0 g을 정확히 평량하여 methanol 또는 H2O 50 ml를 가해 각각 실온 및 Ultra sonic으로 60분간 3회 반복 추출, 여과 및 감압농축후 동결건조하여 methanol 또는 H2O 추출물을 얻었다. 이를 HPLC용 CHCN3 10 ml에 용해시킨 후 0.
- 45 ㎛ membrane filter로 여과한 여액을 검액으로 사용하였다. 각각의 검액 10μl를 HPLC에 주입하여 chromatogram의 면적을 얻었고 회귀직선 방정식으로부터 각각의 지표물질의 함량을 구하였다.
- 중약대사전 및 포제법에 수록된 수치 방법과 최근 새로이 연구 보고된 수치법인 전자오븐에서 마이크로파로 처리하는 방법을 선정하여 시험하였다. 1법은 시료를 물에 담구었다가 6시간 가열하고 2법은 매일 2회 15일간 물을 갈아주고 일정 량의 감초와 흑두를 전탕한 액에 초오를 혼합하여 4시간 가열하며 3법은 증류수 및 1% NaHCO3 50, 120ml에 침적시킨 후 5분, 10분간 마이크로파 처리하였다.
- 방법을 선정하여 시험하였다. 1법은 시료를 물에 담구었다가 6시간 가열하고 2법은 매일 2회 15일간 물을 갈아주고 일정 량의 감초와 흑두를 전탕한 액에 초오를 혼합하여 4시간 가열하며 3법은 증류수 및 1% NaHCO3 50, 120ml에 침적시킨 후 5분, 10분간 마이크로파 처리하였다. 각각의 검체는 MeOH 또는 증류수로 추출한 후 HPLC로 분석한 결과를 Table Ⅰ 및 Ⅱ에 정리하였다.
- HPLC의 분석조건으로는 Nova-Pak CN column을 이용하여 acetonitrile : phosphoric acid (pH 3.0) = 50 : 50 (v/ v%)을 유속 1.0m//min으로 용출시킴으로써 각각 retention time 약 5.0, 5.8, 6.2분에서 mesaconitine, aconitine 및 hypacontine의 peak(Fig. 1)을 양호하게 분리 할 수 있었으며, Fig. 2와 같은 calibration curve를 얻었고 검 량선에 대한 상관계수는 1에 접근하여 이를 이용하여 각 시료에 함유된 mesaconitine, aconitine, hypacontine의 함량을 구하였다.
- 수치 2법은 하루에 2회 15일 동안 물을 갈아주어 1일, 2 일, 3일, 5일, 7일, 11일, 13일, 15일의 갈아준 물에 함유된 alkaloid의 함량을 측정하였는데(Table Ⅲ 시간이 지날수록 alkaloid의 함량은 전반적으로 감소하였다. 수치 2법은 다른 수치 법에 비하여 alkaloid 함량이 현저히 낮으므로 15일 동안 갈아준 물에 alkaloid가 많이 추출되어 함량이 감소하는 경향을 나타내었다.
대상 데이터
- 실험재료 - 본 실험에 사용된 초오는 중국산과 한국산을 경동시장에서 구입하여 잡질을 제거한 후 사용하였다. 표준품은 중앙대 황완균 교수님의 감정 후 사용하였고 표본실에 보관중이며, 가공부자말(중국산)은 한풍제약제품을 사용하였다.
- 표준품은 중앙대 황완균 교수님의 감정 후 사용하였고 표본실에 보관중이며, 가공부자말(중국산)은 한풍제약제품을 사용하였다.
- 기기 및 시약 - Microwave Oven 은 K0R-811K (Daewoo), HPLC는 Shimadzu LC-lOAVP (Japan), Negative-ion FAB-Mass Spectrometer는 VG70-VSEQ(England), 1H-NMR와 l3C-NMR Spectrometer는 Bruker (Germany)를 사용하였다.
- Column 은 Nova-Pak CN (3.9x300 mm, Waters)를 사용하였고 이동상으로는 acetonitrile - pH 3.0 phosphoric acid = 50 : 50 (v/v)이 되도록 하였다. 유속은 1.
- HPLC 조건 - HPLC는 Shimadzu LC-10AVP System으로서 LC-10ATVP Pump, SPD-10AVP UV-VIS Detector, SIL-10ADVP Auto Injector (Japan)를 사용하였다. Column 은 Nova-Pak CN (3.
성능/효과
- Table I과 Table II는 초오의 MeOH 추출물과 H2O 추출물의 alkaloid함량을 나타낸 것인데 수치 전에 가공부자보다 상당히 많은 양의 mesaconitine, aconitine, hypaconitine을 함유하고 있으며 수치 후에는 수치전보다 alkaloid 함량이 감소하였으며 수치 방법에 따라 alkaloid의 함량은 현저히 달랐고 H2O 추출물의 경우 수치전, 후에 모두 중국산이 한국산보다 aconitine과 mesaconitine이 함량이 많았다.
- 수치 1법과 2법은 수치 3법에 비하여 alkaloid 함량이 훨씬 감소하였으며 3종류의 alkaloid의 함량이 가공부자의 alkaloid 함량보다 낮아졌다. 수치 2법의 MeOH 추출물의 경우 다른 수치법에 비하여 alkaloid 함량이 현저히 감소하였으며 H2O 추출물은 중국산 초오에서 aconitine만 33.
- 함량보다 낮아졌다. 수치 2법의 MeOH 추출물의 경우 다른 수치법에 비하여 alkaloid 함량이 현저히 감소하였으며 H2O 추출물은 중국산 초오에서 aconitine만 33.690 ㎍/g으로 검출되었고 다른 alkaloid는 검출되지 않았다. 수치 1법은 MeOH 추출물의 경우 alkaloid 함량이 전반적으로 수치 2법 정도로 감소하였으며 H2O 추출물의 경 우 한국산에서 aconitine이 82.
- 690 ㎍/g으로 검출되었고 다른 alkaloid는 검출되지 않았다. 수치 1법은 MeOH 추출물의 경우 alkaloid 함량이 전반적으로 수치 2법 정도로 감소하였으며 H2O 추출물의 경 우 한국산에서 aconitine이 82.225 ㎍/g, hypaconitine 107.467 |ig/g 검출된 것을 제외하고는 수치 2법 정도로 감소하였다.
- 함량은 전반적으로 감소하였다. 수치 2법은 다른 수치 법에 비하여 alkaloid 함량이 현저히 낮으므로 15일 동안 갈아준 물에 alkaloid가 많이 추출되어 함량이 감소하는 경향을 나타내었다.
- 증류수를 이용하여 전자오븐에서 5분 또는 10분간 처리하였을 때 (수치 3-1, 3-2법)한 중국산 MeOH 추출물의 경우 aconitine 116.0|㎍/g 및 40.1㎍/g, hypaconitine은 386.3 ㎍/g 및 145.7㎍/g으로써 함량이 수치전보다 저하되었으며 10 분간 처리하였을 때 가공부자 수준으로 저하되었다. mesa-conitine 은 각각 628.
- 수치 3-4법은 1% NaHCO3 120ml에 침적 후 10분간 마이크로파 처리하는 것인데 H2O 추출물의 경우 중국산에서 hypaconitine만 179.152 ㎍/g 검출될 뿐 mesaconitine과 aconitine은 검출되지 않았으며 1% NaHCO3 용액에 침적시킨 후 마이크로파 처리하였을 때는 전반적으로 가공부자의 alkaloid함량보다 훨씬 낮아졌다.
- 1. 초오는 수치 전에는 가공부자보다 상당히 많은 양의 alkaloid을 함유하고 있으며 수치 후에는 수치 전보다 alkaloid 함량이 감소하였으며 수치 방법에 따라 alkaloid의 함량은 현저히 달랐다.
- 2. 수치 1법과 2법은 수치 3법에 비하여 alkaloid 함량이 훨씬 감소하였으며 3종류의 alkaloid의 함량이 가공부자의 alkaloid 함량보다 낮아졌다.
- 3. 전자오븐에서 5분 또는 10분간 처리한 (수치 3-1, 3-2 법) 중국산 MeOH 추출물의 경우 aconitine은 10분간 처리하였을 때 가공부자 수준으로 저하되었고 mesaconitine은 5분간 처리할 때 가공부자 수준으로 함량이 저하되었다. 1% NaHCO3 용액에 침적시킨 후 마이크로파 처리하였을 때(수치 3-4법)는 전반적으로 가공부자의 alkaloid 함량보다 훨씬 낮아졌다.
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