[논문]부추 추출 성분의 항발암 효과 연구

박윤자; 김미향; 배송자

부추 추출 성분의 항발암 효과 연구
Anticarcinogenic Effects of Allium tuberosum on Human Cancer Cells 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.34 no.4 = no.164, 2002년, pp.688 - 693

박윤자 (신라대학교 식품영양학과) , 김미향 (신라대학교 식품영양학과) , 배송자 (신라대학교 식품영양학과)

초록
AI-Helper

천연물을 이용하여 생리활성이 있는 성분을 추출 분리하여 그 유효 성분을 탐색함으로써 질병 예방 및 치료제로 이용하고자 하는 연구가 최근 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 예부터 혈액 순환을 돕고, 지혈 작용에 효과가 있는 것으로 알려져 있는 식탁에 상용되는 야채인 부추를 이용하여 4종의 인체 암세포주인 HepG2, HeLa, MCF7 및 SK-N-MC를 이용하여 암세포 증식억제 및 암예방 QR 유도활성 효과를 측정하였다. MTT assay를 이용한 암세포 증식억제 실험 결과, 4종의 암세포주 모두 ethylether층인 ATMEE에서 아주 높은 농도 의존적이 암세포 증식억제 효과를 보였다. 즉 본 실험에 사용된 인체 암세포주 4종에서 시료의 농도가 $150\;{\mu}g/mL$일 때 각 세포주 모두 약 90% 이상의 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났으며, 특히 신경아종세포주인 SK-N-MC 에서는 ethylether층의 시료 농도를 다른 층을 첨가시의 농도보다 적은 $100\;{\mu}g/mL$ 첨가에서도 이미 99.8%의 아주 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었다. 또 신경아종세포인 SK-N-MC에서는 ethylacetate층인 ATMEA의 경우에서도 최종 첨가 시료농도를 $200\;{\mu}g/mL$ 첨가했을 때 이미 91%의 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났다. 암예방 quinone reductase(QR) 유도활성을 측정한 결과, 시료의 butanol 분획물 ATMB를 $50\;{\mu}g/mL$ 첨가했을 때 시료무처리구인 대조군을 1.0으로 한 경우 암예방 QR유도 효과가 아주 높은 3.92배의 활성이 나타났다. 본 연구 결과, 인체암세포 4종류에 대한 암세포 증식억제(cytotoxicity) 효과는 부추의 ethylether 분배층(ATMEE)에서 제일 뚜렷하였고, 암예방 QR 유도활성 효과는 butanol 분배층(ATMB)에서 가장 유도효과가 좋았다. 나아가 단계적인 생리활성 물질의 분리 동정이 계속 이루어져야 할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The anticarcinogenic effects of various food components have received much attention in recent years. However mechanism of anticarcinogens in food materials on cancer cells have rarely been investigated. This study was performed to investigate the effects on the cytotoxicity and quinone reductase (QR) activity of Allium tuberusum (AT) on the human cancer cells. The six partition layers which are methanol (ATM), hexane (ATMH), ethylether (ATMEE), ethylacetate (ATMEA), butaonl (ATMB) and aqueous (ATMA) of Allium tuberusum were screened for their cytotoxic effects on HepG2, MCF-7, HeLa and SK-N-MC cells by the MTT assay. Among the six partition layers, ATMEE had the strongest cytotoxic effect at concentration of $150\;{\mu}g/mL$ which resulted over 95% on HepG2, HeLa, MCF-7 and SK-N-MC cell lines. The ATMEA also showed significant cytotoxic effect on HepG2 and SK-N-MC cell lines. The ATMB showed the highest induction activity of QR on HepG2 cells among the other partition layers. QR activity of HepG2 cells, grown in the presence of ATMB at the concentration of $50\;{\mu}g/mL$, was increased by 3.9 times, compared to the control value of 1.0. Based on these results, the ATMEE and ATMB may have potentially anticarcinogenic and chemopreventive activities.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

특히 alliium 속에 속하는 식품 중 마늘과 양파에 대한 암 예방 효과 등 생리적 기능에 대한 연구가 많이 이루어져 왔으며^(10-12), 부추의 경우 혈액성상 및 혈소판 응집⁽¹³⁾, 휘발성 향기 성분⁽¹⁴⁾, 암 예방 효소계 및 혈중 웅성호르몬 농도에 미치는 영향⁽¹⁵⁾ 등이 국내에서 연구되어 왔다. 본 연구에서는 우리나라 남성암의 주된 원인인 간암과 여성암의 주된 원인인 자궁 경부암, 유방암 및 신경아종 등 인체 암세포주에 미치는 부추 추출 성분의 암세포 증식억제 (cytotoxicity) 효과와 암 예방 효소계인 quinone reductase의 유도활성 효과를 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었으므로 보고하는 바이다.

제안 방법

각 세포주를 1×10⁵ cells/well 농도로 맞추고 24well에 각각 1mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃5% CO₂ incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 50, 100, 150, 200 및 250㎍/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액(3㎎/mL)을 100μL씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1 : 1로 혼합한 용액 1mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 570㎚, 690㎚에서 각각 흡광도를 즉정하여 대조군 세포 수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
HepG2, HeLa, MCF-7 및 SK-N-MC의 각 인체 암세포주에 부추의 용매 분획별 시료를 각각 100, 200, 300, 400 및 500㎍/mL 첨가하고 72시간 배양하면서 대조군과 실험군의 세포 모양 변화를 현미경으로 관찰하였다.
QR생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법⁽¹⁸⁾을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양 중인 HepG2세포가 80%이상 증식하게 되면 24well plate의 각 well에 1×10⁴, cells/mL 되도록 HepG2세포를 분주하여 , 37℃5% CO₂ incubator에 24시간 동안 배양한 후 부주 추출물을 각각 DMSO에 녹여 20, 30, 40 및 50㎍/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다.
. 각 세포주를 1×10⁵ cells/well 농도로 맞추고 24well에 각각 1mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃5% CO₂ incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 50, 100, 150, 200 및 250㎍/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액(3㎎/mL)을 100μL씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1 : 1로 혼합한 용액 1mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 570㎚, 690㎚에서 각각 흡광도를 즉정하여 대조군 세포 수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
즉 T-75 flask에서 배양 중인 HepG2세포가 80%이상 증식하게 되면 24well plate의 각 well에 1×10⁴, cells/mL 되도록 HepG2세포를 분주하여 , 37℃5% CO₂ incubator에 24시간 동안 배양한 후 부주 추출물을 각각 DMSO에 녹여 20, 30, 40 및 50㎍/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250rL의 lysis buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 14mM NaCl, 15mM MgCl₂)를 혼합하여 well에 1mM씩 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, 반응 정지 용액인 10.3mM dicumarol, 0.5% pyridine, 5mM potassium phos-phate(pH 7.4) 혼합액을 250μL씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 610㎚에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다.
본 실험에서는 암세포 증식억제 효과 실험에서 시용된 인체 암세포 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 인체 간암세포주인 HepG2를 이용하여 QR 유도 활성 효과를 측정하였으며, 그 결과는 Fig. 5와 같다.
본 실험은 인체 간암세포주인 HepG2, 자궁 경부암 세포주인 HeLa, 유방암세포주인 MCF7 및 신경아종세포주인 SK-N-MC의 인체 암세포를 이용하여 암세포 증식억제 효과를 보았으며, 그 결과는 Fig. 1, 2, 3 및 4에 나타내었다.
본 연구에서는 옛부터 혈액 순환을 돕고, 지혈작용에 효과가 있는 것으로 알려져 있는 식탁에서 상용되는 야채인 부추를 이용하여 4종의 인체 암세포주인 HepG2, HeLa, MCF7 및 SK-N-MC를 이용하여 암세포 증식억제 및 암 예방 QR 유도활성 효과를 측정하였다.
시료로 사용된 부추는 건조 후 분말화하여 메탄올을 첨가한 후 37℃에서 진탕배양 한 후 4시간 동안 3회 반복 추출하고 회전식 진공 농축기로 감압 농축시킨 후 동결 건조하였으며, 부추의 methanol 추출물(ATM)을 얻은 후 각 용매별로 분획하여 hexane층(ATMH), ethylether층(ATMEE), ethylac-etate층(ATMEA), butanol층(ATMB) 및 수층 분획물(ATMA)로 각각 분획하고 각 층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.
암세포 배양을 위한 기기로는 CO₂ incubator(Forma scientific 3546, USA)를 사용하였고, 그외 clean bench(Vision Sci-centific Co, LTD. VS-1400LS), rotary evaporator(Tokyo rikakikai Co, LTD, NN10522423, Japan), microscopy(Leica Mikroskopie & systeme Gmbh Wezlas 520802, Germany), deep freezer(Ilsin Enginering Co, DF 9071) 및 UV-spectro-photometer(Pharmacia Biotech 80-2105-20) 등을 사용하여 결과를 얻었다.
3%)의 추출물(ATM)을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 hexane(ATMH), ethyl-ether(ATMEE), ethylacetate(ATMEA), butanol(ATMB) 및 수층(ATMA)의 용매별로 분획하여 ATMH층은 1.8 g(3.7%), ATMEE 층은 0.4g(0.8%), ATMEA 층은 0.8g(1.7%) 및 ATMB층은 17.8g(36.9%)을 얻었고, 나머지 ATMA층은 27.5g(56.9%)의 분획물을 얻었다.
엄궁 농산물시장에서 구입하여 음건하였다. 이 시료를 추출·분획하여 각 암세포주에 대한 암세포 증식억제 효과(cytotoxicity)와 quinone reductase(QR) 유도 활성 물질 검색에 사용하였다.
변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양 중인 HepG2세포가 80%이상 증식하게 되면 24well plate의 각 well에 1×10⁴, cells/mL 되도록 HepG2세포를 분주하여 , 37℃5% CO₂ incubator에 24시간 동안 배양한 후 부주 추출물을 각각 DMSO에 녹여 20, 30, 40 및 50㎍/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250rL의 lysis buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.

대상 데이터

HepG2, HeLa 및 MCF-7세포주는 DMEM medium에, SK-M-N-MC 세포주는 MEM medium에 10% fetal bovine serum(FBS)와 1% lOOunits/mL의 penicillin strepto-mycin이 함유된 배지를 사용하여, 37℃ 5% CO, incubator에서 monolayer로 배양하였다.
본 실험에 사용된 부추(AHium tuberosum)는 2000년 5월 부산 엄궁 농산물시장에서 구입하여 음건하였다. 이 시료를 추출·분획하여 각 암세포주에 대한 암세포 증식억제 효과(cytotoxicity)와 quinone reductase(QR) 유도 활성 물질 검색에 사용하였다.
본 실험에 사용한 암세포주는 인체 간암 세포인 HepG2(human hepatocellular carcinoma), 자궁 경부암 세포인 HeLa(human cervix adenocarcinoma), 유방암 세포인 MCF-7(human breast adenocarcinoma pleural effusion) 및 신경아종 세포인 SK-N-MC(human brain neuroblastoma)로서 2000년 5월 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하였다. HepG2, HeLa 및 MCF-7세포주는 DMEM medium에, SK-M-N-MC 세포주는 MEM medium에 10% fetal bovine serum(FBS)와 1% lOOunits/mL의 penicillin strepto-mycin이 함유된 배지를 사용하여, 37℃ 5% CO, incubator에서 monolayer로 배양하였다.
암세포 증식억제 실험에 사용된 시약 중 NP-40과 menadi-onee Sigma사(St, Louis. USA) 제품을 사용하였고 flavin adenine dinucleotide(FAD), dicumarol 및 glucose-6-phosphate dehydrogenase는 Amresco사(USA)에서, minimum essential medium(MEM), Dulbeco's Eagle modified medium(DMEM)과 phosphate buffered saline(PBS) 등은 Gibco-BRL(Grand Island Biologic Co. USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.

이론/모형

4) 혼합액을 250μL씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 610㎚에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다. Quinone reductase 활성 측정(nmol/min/㎎ protein)은다음과 같이 하였다.
부추 추출 분획물의 암세포 증식 3제 효과는 3-(4, 5-dime- thylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT assay)를 사용하여 행하였다^(16,17)). 각 세포주를 1×10⁵ cells/well 농도로 맞추고 24well에 각각 1mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃5% CO₂ incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 50, 100, 150, 200 및 250㎍/mL의 농도로 첨가하였다.

성능/효과

46%의 높은 효과를 나타내었으며, 그 다음으로 ATMEEA층의 경우 최고 농도인 250㎍/mL를 첨가하였을 때 약 42%의 약한 효과를 보였을 뿐 그 외의 분획층은 거의 효과가 없었다. Fig. 4는 신경아종세포인 SK-N-MC에 대한 부추 분획물 첨가 시의 암세포 증식억제 효과를 나타낸 것으로, ATMEE층을 낮은 첨가 농도인 100㎍/mL 첨가했을 때 이미 98.93%의 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났으며, ATMEEA층의 경우에서도 앞서 실험한 다른 세 종류의 암세포주와는 다르게 최고 첨가 시료농도 200㎍/mL를 첨가시 약 89.73%의 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었다.
MTT assay를 이용한 암세포 증식억제 실험 결과, 4종의 암세포주 모두 ethylether층인 ATMEE에서 아주 높은 농도 의존적인 암세포 증식억제 효과를 보였다. 즉 본 실험에 사용된 인체 암세포주 4종에서 시료의 농도가 150㎍/mL일 때 각 세포주 모두 약 90% 이상의 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났으며, 특히 신경아종세포주인 SK-N-MC에서는 ethylether층의 시료 농도를 다른 층을 첨가 시의 농도보다 적은 100㎍/mL 첨가에서도 이미 99.
8%의 아주 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었다. 또 신경아종세포인 SK-N-MC에서는 ethylacetate층인 ATMEA의 경우에서도 최종 첨가 시료 농도를 200㎍/mL 첨가했을 때 이미 91%의 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났다.
본 연구 결과, 인체암세포 4종류에 대한 암세포 증식억제(cytotoxicity) 효과는 부추의 ethylether 분배층(ATMEE)에서 제일 뚜렷하였고, 암 예방 QR 유도활성 효과는 butanol 분배층(ATMB)에서 가장 유도효과가 좋았다. 나아가 단계적인 생리활성 물질의 분리 동정이 계속 이루어져야 할 것으로 사료된다.
암 예방 quinone reductase(QR) 유도활성을 측정한 결과, 시료의 butanol 분획물 ATMB를 50㎍/mL 첨가했을 때 시료 무처리구인 대조군을 1.0으로 한 경우 암 예방 QR유도 효과가 아주 높은 3.92배의 활성이 나타났다.
이상의 결과에서 HepG2, HeLa, MCF7 및 SK-N-MC 세포주에 부추의 각 분획물을 첨가했을 때 암세포 증식억제 효과는 4종의 암세포주에서 모두 ethylether층(ATMEE)이 아주 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었으며, 특히 신경아종세포인 SK-N-MC의 경우 ethylacetate층(ATMEA)에서도 비교적 유의성 있게 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었다. 암세포 증식억제 효과의 연구 중 한 등⁽²⁰⁾은 당근 추출성분 중 당근의 ethylacetate 분획층에서 암세포 증식억제 효과가 나타남을 보고하였고, 박 등⁽²¹⁾은 돌나물 추출물 중 비극성용매 부분인 ethylether 분획층에서 암세포 증식억제 효과가 높게 남을 보고하였다.
이와 같이 천연물이나 식품재료를 첨가한 결과^(25,26)와 비교해보면 암 예방 QR 유도활성 결과는 일반적으로 시료 최고첨가농도인 100㎍/mL에서 최고 효과가 나타났으나, 본 실험에 사용한 부추의 ATMB 분획물의 QR 유도활성은 일반적으로 가하는 시료의 절반의 첨가농도인 50㎍/mL에서도 그 효과가 매우 크다고 볼 수 있다. 식탁의 애용품인 부추를 이용한 암예방 건강 대체 식품으로서의 계속적인 연구를 진행 중에 있다.
44% 정도의 유의적인 효과를 보였으나, 그외 다른 분획물에서는 암세포 증식억제 효과는 거의 나타나지 않았다. 인체 자궁암세포인 HeLa에 대한 암세포 증식억제 효과는 Fig. 2에 나타내었으며 HeLa 세포주에서도 HepG2세포주의 결과에서와 같이 ATMEE층이 다른 분획물에 비해 독자적으로 높은 암세포 증식 억제 효과를 보였으며, 시료의 농도를 150㎍/mL로 첨가했을 때 이미 94.45%의 높은 효과를 나타내었고, 점차적으로 농도를 증가시켰을 때 지속적인 효과를 나타내었다. 유방암세포인 MCF-7의 결과는 Fig.
암세포 증식억제 효과를 보였다. 즉 본 실험에 사용된 인체 암세포주 4종에서 시료의 농도가 150㎍/mL일 때 각 세포주 모두 약 90% 이상의 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났으며, 특히 신경아종세포주인 SK-N-MC에서는 ethylether층의 시료 농도를 다른 층을 첨가 시의 농도보다 적은 100㎍/mL 첨가에서도 이미 99.8%의 아주 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었다. 또 신경아종세포인 SK-N-MC에서는 ethylacetate층인 ATMEA의 경우에서도 최종 첨가 시료 농도를 200㎍/mL 첨가했을 때 이미 91%의 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났다.
1은 간암세포주인 HepG2에 부추 용매 분획별 시료의 농도를 50, 100, 150, 200 및 250㎍/mL로 증가시키면서 첨가하였을 때의 암세포 증식억제 효과를 나타낸 것으로, 부추의 여러 분획물 중 ethylether층(ATMEE)이 간암세포주인 HepG2의 암세포 증식을 매우 억제하였다. 즉, ATMEE층을 150㎍/mL의 농도로 첨가했을 때 이미 약 83.17%의 높은 증식억제 효과를 보였으며, 이후 농도를 증가시킨 200㎍/mL에서는 99.37%의 괄목할 만큼 아주 높은 증식억제 효과가 나타났다. 한편, ethylacetate층(ATMEA)은 최고 농도인 250㎍/mL을 첨가했을 때 비로소 46.
B는 ethylether층인 ATMEE, C는 ethylacetate층인 ATMEA의 세포 형태학적 관찰 사진인다. 즉, MCF-7 세포주는 세포의 형태가 방추형이며 1개 이상의 핵소체가 있는 핵을 가지고 있었으나, 첨가 시료 분획물 즉 ATMEE 및 ATMEA의 농도가 증가될수록 원래의 암세포 형태는 소멸되어 점점 그 수가 저하됨으로서 암세포 증식억제를 나타내었으며, 점차 각 세포들의 부착능력이 없어지면서 시료 첨가에 의한 암세포증식이 감소되었음을 확실히 알 수 있었다.
1 및 2의 결과와 같이 역시 ATMEE층이 월등히 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었다. 즉, 시료 농도 150㎍/mL로 첨가했을 때 HepG2 세포주의 결과와 비슷한 85.46%의 높은 효과를 나타내었으며, 그 다음으로 ATMEEA층의 경우 최고 농도인 250㎍/mL를 첨가하였을 때 약 42%의 약한 효과를 보였을 뿐 그 외의 분획층은 거의 효과가 없었다. Fig.
즉, 시료 무처리구인 대조군을 1.0으로 했을 때 부추의 butanol층인 ATMB에서 첨가 최종 농도인 50㎍/mL로 첨가했을 때 3.93배의 아주 높은 QR 유도활성이 나타났으며, 이 층을 제외한 다른 분획물에서는 유의적인 QR 유도활성이 나타나지는 않았다. 이런 천연물이나 식품을 대상으로 한 연구 중 한 등⁽²³⁾은 당귀의 추출물과 헥산 분배층이 HepG2 세포에서 QR 효소 활성을 증가시켰다고 하였으며, 김 등⁽²⁴⁾의 연구에 의하면 들깨박의 methanol 추줄물이 Hepalclc7 세포계에서 QR 효소 활성을 증가시켰으며 이것은 비극성이 강한 물질일 것으로 보고하였다.

후속연구

암세포 증식억제 효과의 연구 중 한 등⁽²⁰⁾은 당근 추출성분 중 당근의 ethylacetate 분획층에서 암세포 증식억제 효과가 나타남을 보고하였고, 박 등⁽²¹⁾은 돌나물 추출물 중 비극성용매 부분인 ethylether 분획층에서 암세포 증식억제 효과가 높게 남을 보고하였다. 이상에서와 같이 부추의 ethylacetate 분획층과 ethylether 분획층은 암세포를 억제시킬 수 있는 생리활성 물질의 개발 가능성이 있는 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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