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문제 정의
- 우리는 감잎의 주성분으로 존재하는 축합형 탄닌들은 다수가 존재하며 생리 활성도 매우 다양하리라 생각되어진다. 그러므로 본 연구는 한국산 감잎 속의 생리활성물질로 알려진 polyphenol 화합물군을 분리하고 예로부터 민간에서 이용되어왔던 감잎의 체계적인 성분 분석과 식품, 화장품의 기능 소재로서 활용 가치를 탐색하여 산업적 활용 가능성을 제시하고자 이 실험을 행하였다.
제안 방법
- 0 cm) 에 10㎕씩 spotting하고 cellulose TLC는 2% acetic acid, silica gel TLC 는 benzene; ethylformic acid; fonnic acid(l:7 :1, 1:7:2 또는 2:5:1, v/v/v)의 용매로 전개한 다음 전개 정도를 자외선에서 확인하였다. Cellulose와 silica TLC상에서 FeCl3에 의해 청색으로 발색되는 물질은 가수분해형 polyphenol로 동정하였으며 silica TLC에서 FeCl3에 비하여 청색으로, anisaldehyde에 의해 갈색으로 발색되는 물질은 축합형 pelyphem)l로 분류하였다.
- TLC에 의한 polyphen이류의 동정. Column에 의해 분리된 용출액을 cellulose 및 silica gel thin layer chromatography (TLC; 5.0 × 5.0 cm) 에 10㎕씩 spotting하고 cellulose TLC는 2% acetic acid, silica gel TLC 는 benzene; ethylformic acid; fonnic acid(l:7 :1, 1:7:2 또는 2:5:1, v/v/v)의 용매로 전개한 다음 전개 정도를 자외선에서 확인하였다. Cellulose와 silica TLC상에서 FeCl3에 의해 청색으로 발색되는 물질은 가수분해형 polyphenol로 동정하였으며 silica TLC에서 FeCl3에 비하여 청색으로, anisaldehyde에 의해 갈색으로 발색되는 물질은 축합형 pelyphem)l로 분류하였다.
- MCI-gel CHP 20P에 의한 정제. MCI-gel은 다공성 p이ystyren gel로서 흡착성을 이용하며 용출용매는 일반적인 reverse phase type 인 H2O→ ethanol로 용줄하고 polyphenol 유무는 TLC 상에서 확인하였다.
- Tyrosinase 활성저해 측정 방법은 tjrosinase의 작용과 생성되는 dopachrome을 비색법에 의해 측정하는 Yagi 등22)의 방법에 따라 행하였다. Mushroom tyrosinase를 90unit/㎖로 되게 하고 이것을 0.5 ㎖, 기질로서 DOPA 0.5 ㎖, buffer 1 ㎖의 혼합액에 시료용액 1 ㎖을 첨가 25°C, 2분간 반응시켜 475nm에서 측정하고 dopachrome의 변화를 저해값으로 환산하였다. 저해활성은 550nm에서 단위 시간당 변화된 초기 흡광도의 변화값(C-D)에 효소액 대신에 증류수를 첨가한 흡광도값과 시료용액 대신에 증류수를 첨가하여 측정한 값(A-B)를 가지고 다음식에 의해 계산하였다.
- Tyrosinase 효소저해 활성측정. Tyrosinase 활성저해 측정 방법은 tjrosinase의 작용과 생성되는 dopachrome을 비색법에 의해 측정하는 Yagi 등22)의 방법에 따라 행하였다.
- 건조된 감잎 10 kg을 60% acetone을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 l,690×g에서 30 분 원심분리하여 상징액과 침전물을 얻었고 이 침전물은 다시 60% acetone을 가하고 위와 같은 추출 과정을 4회 반복하였다. 각각의 상징액을 모아 농축 여과하여 chlorophyll을 제거하고 2L의 농축물로 만든 후 acetone 추출물로서 분획을 위한 시료로 하였다.
- 감잎 아세톤 추출물의 분리. 건조된 감잎 10 kg을 60% acetone을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 l,690×g에서 30 분 원심분리하여 상징액과 침전물을 얻었고 이 침전물은 다시 60% acetone을 가하고 위와 같은 추출 과정을 4회 반복하였다. 각각의 상징액을 모아 농축 여과하여 chlorophyll을 제거하고 2L의 농축물로 만든 후 acetone 추출물로서 분획을 위한 시료로 하였다.
- 감잎의 아세톤 추출물의 분리. 건조된 감잎 10 kg을 Fig. 1 과 같이 60% acetone을 가하여 실온에서 24 시간 추출한 후 l,690×g에서 30 분간 원심분리하여 상징액과 침전물을 얻었고 이 침전물은 다시 60% acetone을 가하고 위와 같은 추출 과정을 4회 반복하였다. 각각의 상징액을 모아 농축 여과하여 chlorophyll을 제거하고 여액 357 g를 2 ℓ의 농축물로 만든 후 acetone 추출물로서 분획하였다.
- 0 cm)에 의해 분획하였다. 용출액은 증류수를 사용하고 용출 속도는 1 ㎖/min로튜브당 3㎖를 취하여 glucosyltransferase, xanthine oxidase, ACE 및 tyrosinase 저해활성 실험을 한 후 동결건조시켰다. 이와 동시에 Sephadex LH-20 column(2.
- Sephadex LH-20 컬럼을 이용하여 흡착성의 성질에 의해 분리하였다. 용출용매는 normal phase type으로서 ethanol→ H2O 및 60% methanol, 60 → 80% methanol과 reverse phase는 H2O → methanol의 순으로 용출시켜 TLC상에서 polyphenol 유무 및 종류를 확인한 후 감압 농축하였다.
- 감잎 분획물 50 mg에 부탄올 5 ㎖을 첨가하고 2시간 동안 교반하고 추출한 후 l,690×g에서 30분간 원심분리하였다. 이 과정을 3회 반복하여 얻은 상징액을 UVMs Spectrophotometer(UV 2401PC, Shimadz Ltd., Japan)로 200- 400 nm파장에서 최대 흡광도 분포를 조사하였다.
- 용출액은 증류수를 사용하고 용출 속도는 1 ㎖/min로튜브당 3㎖를 취하여 glucosyltransferase, xanthine oxidase, ACE 및 tyrosinase 저해활성 실험을 한 후 동결건조시켰다. 이와 동시에 Sephadex LH-20 column(2.5×500cm)에도 아세톤 추출물에서 동결건조된 350 mg을 loading하여 분획하고 용출 용매는 물과 methanol을 사용하며 유줄 속도는 0.8㎖/min로 3㎖씩 취하여 저해실험을 한 후 분획별로 동결건조하였다.
- 5 ㎖, buffer 1 ㎖의 혼합액에 시료용액 1 ㎖을 첨가 25°C, 2분간 반응시켜 475nm에서 측정하고 dopachrome의 변화를 저해값으로 환산하였다. 저해활성은 550nm에서 단위 시간당 변화된 초기 흡광도의 변화값(C-D)에 효소액 대신에 증류수를 첨가한 흡광도값과 시료용액 대신에 증류수를 첨가하여 측정한 값(A-B)를 가지고 다음식에 의해 계산하였다.
- Glucosyl transferase 저해 활성 측정은 일본 동경대학 Endo 등21) 의 방법에 따라 행하였다. 즉 시료용액 0.18 ml, sucrose-NaNg의 기질 Q.8㎖와 GTase 0.02 ㎖를 혼합하여 1 ㎖로 한 후 37℃에서 16시간 반응시켜 그 상징액을 버리고 증류수 3 ㎖를 가해 ultrasonicator로 균질화 한 다음 550nm에서 흡광도를 측정한 후 다음 식에 따라 % 저해율로서 구하였다.
- 흡광 분포도 측정 . 감잎 분획물 50 mg에 부탄올 5 ㎖을 첨가하고 2시간 동안 교반하고 추출한 후 l,690×g에서 30분간 원심분리하였다.
대상 데이터
- 값이다. Sucrose 12.5 g, sodium azide 0.25 g 을 0.062 M potassium phosphate buffer (pH 6.5) 1ℓ에 혼합하여 조제하였으며 GTase 는 일본 합동 주정에서 구입한 원액의 15배 희석액을 실험에 사용하였다.
- 공시재료.본 실험에 사용된 감잎(Diospyms kaki L. Folium)은 청도, 창령 및 상주에서 재배하는 감나무인 청도 반시, 창녕부유, 상주둥시의 3품종에서 1996년 5월부터 9월까지 새순에서 돋아나는 두번째 내지 세번째 잎을 채취하였다. 채취한 감잎은 표면의 이물질을 제거한 후 polyethylene Him에 넣어 -20℃ 냉동고에 보관하면서 사용하였다.
- Octadecyl silica gel(ODS)에 의한 분리. 본 실험에서는 Bondapak C18, Prep-BAK 500/C18, Fuji-gel ODS G3, Cosmosil 75 C18-OPN을 주로 사용하였고 추출 용매로서는 H2O → methanol type을 사용하였다.
- Tbyopearal HW 40(TSK gel). 친수성 vinyl polymer로서 본 실험에서는 30〜60 ㎛ 입자 크기의 gel을 사용하였고 용출용매로서는 H2O → methanol, H2O → acetone type을 병용 하였다.
이론/모형
- Glucosyl transferase 저해 활성 측정은 일본 동경대학 Endo 등21) 의 방법에 따라 행하였다. 즉 시료용액 0.
- Tyrosinase 효소저해 활성측정. Tyrosinase 활성저해 측정 방법은 tjrosinase의 작용과 생성되는 dopachrome을 비색법에 의해 측정하는 Yagi 등22)의 방법에 따라 행하였다. Mushroom tyrosinase를 90unit/㎖로 되게 하고 이것을 0.
- 감잎 추출물의 성상과 Sephadex G-50에 의한 분획결과 효소저해 활성 물질로 생각되어지는 화합물은 polyphenol류라 추정하게 되었으므로, Fig. 4와 같이 polyphenol류 분리방법에 의해 단일 물질을 분리하였다. Fl, F2, F3의 fraction으로 분획한 후 F1 fiaction에서 compound 1~4까지 4종류의 화합물이, F-2 fraction에서는 compounds 5, 6을 순수정제하여 재결정시켰다.
성능/효과
- 91%였다(Table 2). 280nm에서 흡광도를 갖는 물질 중 80% 이상이 용출되었으나 회수율은 전체 loa血g양에 비해 12.4%로 매우 낮은 수율을 보여주었다.
- 실험에서 Sephadex LH-20 gel에 H2O 와 methanol 혼합용액의 농도 변화를 용줄한 결과 methanol 30%에서 흡착성이 약한 proanthocyanidin류가 보이기 시작하여 90% methanol에서 거의 모든 화합물이 용출되는 것으로 확인되었다. Ethanol용액에서는 monomer, dimer, trimer순으로 용출되었고, MCI-gel, Bondapak C18 column에서는 methanol 40% 이내에서 용출되는 것이 확인되었다.
- 부분정제에 의한 효소저해효과. GTase에 대한 저해 활성을 조사한 결과 A 와 B 분획물에서 각각 93.32, 50.59%의 저해가 관찰되었고(Table 3), tyrosinase 저해도 A, B 분획물에서 38.55, 39.75%의 저해 효과가 관찰된 바 280nm에서 최대 흡광치를 갖는 물질 중 분자량이 높고, gel에 잘 용출되는 물질로 추정된다(Table 3, 4).
- TLC상에서 재결정화 된 화합물은 대체로 하층에 전개되어 있음을 확인하였다. 반응 색깔에 있어서 anisaldehyde-H2SO4, 정색반응시 붉은색을 보었고 FeCl3 용액에서는 청색를 나타냈다.
- Fl, F2, F3의 fraction으로 분획한 후 F1 fiaction에서 compound 1~4까지 4종류의 화합물이, F-2 fraction에서는 compounds 5, 6을 순수정제하여 재결정시켰다. 각 compound를 TLC상에서 확인한 결과 polyphenol 화합물이라 추정되는 monomer가 2종류, dime가 3종류, trimer가 종류로 확인되었고 FeCl3와 anisaldehyde 용액으로 spray시킨 결과 각각 청색과 갈색반응을 나타내었으므로 proanthocyanidin 계통으로 추정하게 되었다. 실험에서 Sephadex LH-20 gel에 H2O 와 methanol 혼합용액의 농도 변화를 용줄한 결과 methanol 30%에서 흡착성이 약한 proanthocyanidin류가 보이기 시작하여 90% methanol에서 거의 모든 화합물이 용출되는 것으로 확인되었다.
- 아세톤 추출물에 의한 효소저해 작용. 감잎 10 kg을 60%의 아세톤으로 가해 추출한 용액 357 g를 동결건조시켜 농도별로 조제하고 glucosyltransferase(Table 1) 및 tyrosinase 저해효과를 관찰한 결과 glucosyltransferase저해는 1.8 × 10-2mg/㎖에서 16.72%의 저해를 시작으로 1.8 × 10-1mg/㎖에서 82.86%, 0.8mg/㎖에서 거의 완벽한 저해가 관찰되었다. Tyrosinase는 0.
- 감잎의 Sephadex G-50 분획물에서 효소저해활성이 강한 A, B fraction의 흡광분포도를 조사한 결과 각각 240~280nm에서 최대 흡광치를 나타내었다(Fig. 3). 이런 최대 흡광치를 갖는 물질로는 DNA, protein 및 phenol ring을 함유한 물질로 추정되었으나 proteinase K 또는 가열처리는 멸균처리에 의해 단백질 변성을 유도하였으나 전혀 glucosyltransferase, tyrosinase 활성 저해 영향이 없었다(Table 5, 6, 7, 8).
- 저해물질의 부분정제에 대한 수율. 감잎의 acetone 농축물 350 mg을 동결건조하여 Sephadex G-50으로 gel filtration 한 결과 A, B, C, D, E의 5부분으로 분획되었고(Fig. 2) 각각의 yield(%)는 A: 54.14%, B: 29.26%, C: 4.6%, D: 8.06%, E: 3.91%였다(Table 2). 280nm에서 흡광도를 갖는 물질 중 80% 이상이 용출되었으나 회수율은 전체 loa血g양에 비해 12.
- 각 compound를 TLC상에서 확인한 결과 polyphenol 화합물이라 추정되는 monomer가 2종류, dime가 3종류, trimer가 종류로 확인되었고 FeCl3와 anisaldehyde 용액으로 spray시킨 결과 각각 청색과 갈색반응을 나타내었으므로 proanthocyanidin 계통으로 추정하게 되었다. 실험에서 Sephadex LH-20 gel에 H2O 와 methanol 혼합용액의 농도 변화를 용줄한 결과 methanol 30%에서 흡착성이 약한 proanthocyanidin류가 보이기 시작하여 90% methanol에서 거의 모든 화합물이 용출되는 것으로 확인되었다. Ethanol용액에서는 monomer, dimer, trimer순으로 용출되었고, MCI-gel, Bondapak C18 column에서는 methanol 40% 이내에서 용출되는 것이 확인되었다.
- 이러한 결과는 분리된 화합물이 flavan-3-ol 골격을 기본으로 하는 축합형 탄닌으로 추정되며 반응 색으로 붉은 정도와 선명도로 보아 화합물 B환에 hydroxyl 기가 1개가 더 결합하고 있거나 다른 부위에 gallate가 함유한 화학구조로 추정되었다. 용출속도에서 결과를 비교해 보면 정제된 화합물은 겔의 흡착정도로 보아 procyandin 계통 (proanthocyandin)으로 추정하게 되었고 분자량은 dimer 이상에서 다른 화합물이 결합되어 있음을 확인 할 수 있었다.
- 있다. 이런 보고를 종합해 보면 감잎내 효소저해 활성 물질은 페놀성 화합물일 가능성을 보여주고 있다.
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