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문제 정의
- 본 연구는 genistein을 침습성이 높은 것으로 알려진 구강 편평세포암종 세포주인 HSC-3에 적용하여, Matrigel® matrix를 이용한 인공 기저막에 대한 침습성에 미치는 영향과 gelatinase-A(matrix metalloproteinase-2: MMP-2)의 용해능 (gelatinolytic activity)에 미치는 영향을 각각 in vitro invasion assay와 gelatin zymography를 통해 알아보고, 신생혈관화 인자인 VEGF와 bFGF의 mRNA발현에 미치는 영향을 Northern blot analysis를 통해 알아보아,궁극적으로 genistein의 구강 편평세포암종에 대한 항암효과를 평가하고자 계획하였다.
- 본 연구에서는 genistein이 구강 편평세포암종 세포주 HSC3에 대해서도 항암효과를 갖는지 평가하기 위하여,in vitro invasion assay, gelatin zymography및 Northern blot analysis를 시행하였다.
제안 방법
- 2 M formaldehyde 겔에 적용하여 전기영동하였다. 20x standard saline citrate (SSC)에서 겔을 nylon 막 (nylon membrane: Hybond N, Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 capillary blotting 시켰으며, 자외선(UV) 하에서 교차결합시켰다. Nylon 막을 50 %(v/v) deionized formaldehyde와 4x SSC의 prehybridization buffer에서 65℃에서 1 시간동안 전처리 후, DIG로 표지된 probe(DIG-labeled probes)와 함께 동일 buffer에서 65℃로 하룻밤 동안 hybridization을 시행하였다.
- 5 ml를 삽입판의 하층에 채워 화학주성제(chemoattractant)로 사용하였다. 24 시간 부란 후,상층에 남아있는 세포를 면봉으로 제거하고, 하층으로 통과한 세포의 수를 측정하기 위하여 5 % glutaraldehyde로 고정하고 hematoxylin으로 염색하여,삽입판의 Matrigel® matrix와 각각의 8 μm 미세 소공을 통과한 세포의 총 수를 광학현미경(x100)으로 관찰하였다..
- Vascular endothelial cell growth factor(VEGF)와 basic fibroblast growth factor(bFGF) mRNA 발현에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction: RT-PCR)으로 VEGF와 bFGF 유전자(gene)를 제작하였다.5 μg의 RNA 견본(sample)을 주형으로 42℃ 에서 50분간 역전사를 시행하였고, cDNA와 10 pmol의 특정 시발체(specific oligonucleotide primer), 200 μM dNTP, 그리고 0.5 U의 Taq DNA polymerase (Perkin Elmer, USA)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하였다.중합효소 연쇄반응은 automated thermal cycler (Perkin Elmer, USA)에서 94℃ 에서 30초간 변성, 58℃ 에서 30초간 가열냉각,그리고 72℃ 에서 60초간 연장을 주기로 30회 시행하였다.
- 획득한 cDNA는 PCRⅡ-TOPO TA vector(Invitrogene, USA)에 삽입하였다. ABI Prism Genetic Analyzer(Perkin Elmer, USA)를 이용하여 sequencing reaction을 시행하였다. DIGhigh prime kit(Boehringer Mannheim, Germany)를 이용한 random priming 방법으로 4μl의 labeling mixture 와 1μg의 PCR 산물을 22시간 동안 부란하여 표지하였다.
- Chemiluminescence의 감지는 Kodak BioMax MS film(Kodak, Japan)과 intensifying screen을 이용하여 상온에서 2 내지 4 시간동안 시행하였다.동일한 조건으로 β-actin mRNA에 대해 northern blotting을 시행하여 VEGF와 bFGF의 신호(signals)를 β-actin signal level로 보정하였다.
- 보합종료 후 nylon 막은 2x SSC와 1x SSC로 2회 세척하였다. DIG-detection을 위해, sheep anti-DIG-AP(Fab fragment)와 CSPD® (Boehringer Mannheim, Germany)를 적용하고,어둡고습한 상자에서 2시간 동안 부란하였다.
- ABI Prism Genetic Analyzer(Perkin Elmer, USA)를 이용하여 sequencing reaction을 시행하였다. DIGhigh prime kit(Boehringer Mannheim, Germany)를 이용한 random priming 방법으로 4μl의 labeling mixture 와 1μg의 PCR 산물을 22시간 동안 부란하여 표지하였다.이와 같이 확정한 fragments를 northern blot analysis의 probe로 이용하였다.
- HSC-3 세포주에 genistein을 10 μM 의 농도로 투여한 실험군 및 HSC-3세포주의 대조군에서 TRI reagent (Molecular Research Center, USA)를 이용하여 총 리보핵산(total cellular RNA)을 추출하였다.변성 후에 RNA sample 10 μg을 1% agarose - 2.
- 15 % Coomassie blue R250으로 20분간 염색하고,염색약이 없는 동일한 용액으로 탈색하였다. HT1080의 배지를 양성 대조군(positive control)으로 사용하였으며, 같은 양의 genistein을 포함한 신선한 비혈장(serum free) DMEM을 내부 음성 대조군(internal negative control)으로 사용하였다.
- 20x standard saline citrate (SSC)에서 겔을 nylon 막 (nylon membrane: Hybond N, Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 capillary blotting 시켰으며, 자외선(UV) 하에서 교차결합시켰다. Nylon 막을 50 %(v/v) deionized formaldehyde와 4x SSC의 prehybridization buffer에서 65℃에서 1 시간동안 전처리 후, DIG로 표지된 probe(DIG-labeled probes)와 함께 동일 buffer에서 65℃로 하룻밤 동안 hybridization을 시행하였다.보합종료 후 nylon 막은 2x SSC와 1x SSC로 2회 세척하였다.
- PCR 산물은 PCR product purification kit(Boehringer Mannheim, Germany)을 이용하여 정제하였다.획득한 cDNA는 PCRⅡ-TOPO TA vector(Invitrogene, USA)에 삽입하였다.
- 중합효소 연쇄반응은 automated thermal cycler (Perkin Elmer, USA)에서 94℃ 에서 30초간 변성, 58℃ 에서 30초간 가열냉각,그리고 72℃ 에서 60초간 연장을 주기로 30회 시행하였다. VEGF와 bFGF의 시발체(oligonucleotide primer)의 염기배열은 기존에 발표된 논문 23)에서와 같이 동일하게 사용하였으며, 5'-CGCGGATCCCTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3' 및 5'-CGGAATTCCT GTAGGAAGCTCATCTCTC-3' (384 bp fragments)를 VEGF에 대해 사용하였으며, 5'-GAGTGTGTGCTAACCGTTA-3' 및 5'-TAGCTTTCTGCCCAGGTCCT-3' (211 bp fragments)를 bFGF에 대해 사용하였다.
- Vascular endothelial cell growth factor(VEGF)와 basic fibroblast growth factor(bFGF) mRNA 발현에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction: RT-PCR)으로 VEGF와 bFGF 유전자(gene)를 제작하였다.5 μg의 RNA 견본(sample)을 주형으로 42℃ 에서 50분간 역전사를 시행하였고, cDNA와 10 pmol의 특정 시발체(specific oligonucleotide primer), 200 μM dNTP, 그리고 0.
- Chemiluminescence의 감지는 Kodak BioMax MS film(Kodak, Japan)과 intensifying screen을 이용하여 상온에서 2 내지 4 시간동안 시행하였다.동일한 조건으로 β-actin mRNA에 대해 northern blotting을 시행하여 VEGF와 bFGF의 신호(signals)를 β-actin signal level로 보정하였다.
- 침습성이 강하다고 알려진 구강 편평세포암종 세포주HSC-3 (JCRB, Japan)를 이용하였다.세포는 37℃에서 습도를 유지하면서 5 % CO2 하에서 배양을 하였고,배양액은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco, USA)에 10 % fetal bovine serum (Gibco, USA)과 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin (Gibco, USA)을 첨가하여 사용하였다.계대배양은 0.
- 5 U의 Taq DNA polymerase (Perkin Elmer, USA)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하였다.중합효소 연쇄반응은 automated thermal cycler (Perkin Elmer, USA)에서 94℃ 에서 30초간 변성, 58℃ 에서 30초간 가열냉각,그리고 72℃ 에서 60초간 연장을 주기로 30회 시행하였다. VEGF와 bFGF의 시발체(oligonucleotide primer)의 염기배열은 기존에 발표된 논문 23)에서와 같이 동일하게 사용하였으며, 5'-CGCGGATCCCTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3' 및 5'-CGGAATTCCT GTAGGAAGCTCATCTCTC-3' (384 bp fragments)를 VEGF에 대해 사용하였으며, 5'-GAGTGTGTGCTAACCGTTA-3' 및 5'-TAGCTTTCTGCCCAGGTCCT-3' (211 bp fragments)를 bFGF에 대해 사용하였다.
대상 데이터
- 세포는 37℃에서 습도를 유지하면서 5 % CO2 하에서 배양을 하였고,배양액은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco, USA)에 10 % fetal bovine serum (Gibco, USA)과 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin (Gibco, USA)을 첨가하여 사용하였다.계대배양은 0.1 % trypsin-EDTA를 이용하여 시행하였고 5~7회 계대배양세포를 실험에 사용하였다.
- 대조군은 genistein 첨가없이 같은 배지에서 배양하였다.인간 섬유세포육종 세포주 HT1080의 배지 0.5 ml를 삽입판의 하층에 채워 화학주성제(chemoattractant)로 사용하였다. 24 시간 부란 후,상층에 남아있는 세포를 면봉으로 제거하고, 하층으로 통과한 세포의 수를 측정하기 위하여 5 % glutaraldehyde로 고정하고 hematoxylin으로 염색하여,삽입판의 Matrigel® matrix와 각각의 8 μm 미세 소공을 통과한 세포의 총 수를 광학현미경(x100)으로 관찰하였다.
- 침습성이 강하다고 알려진 구강 편평세포암종 세포주HSC-3 (JCRB, Japan)를 이용하였다.세포는 37℃에서 습도를 유지하면서 5 % CO2 하에서 배양을 하였고,배양액은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco, USA)에 10 % fetal bovine serum (Gibco, USA)과 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin (Gibco, USA)을 첨가하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 최소한 3회 이상 반복하였으며,실험군 및 대조군 간의 통계적 유의성은 Mann-Whitney U test를 이용하여 유의수준 95 %로 검증하였다.
- 5 μg) 중 MMP2 비활성 상태의 용해능을 MMP-2의 10 상대단위(arbitrary unit: U)로 정의하였다.비활성 상태와 활성 상태의 용해능 및 총 효소 용해능은 TINA 2.0 software(Raytest Isotopenmessgeraete GmbH, Germany)를 이용한 2- dimensional densitometric analysis로 측정하였다.
이론/모형
- MMP-2의 비활성 상태(72 kDa)와 활성 상태(62 kDa)의 젤라틴용해능은 이전 연구22)에 따라 분석하였다.최초 배양된 정상 구강점막 섬유아세포의 배지 10 μl(총 단백질 0.
- DIGhigh prime kit(Boehringer Mannheim, Germany)를 이용한 random priming 방법으로 4μl의 labeling mixture 와 1μg의 PCR 산물을 22시간 동안 부란하여 표지하였다.이와 같이 확정한 fragments를 northern blot analysis의 probe로 이용하였다.
성능/효과
- 또한, gelatin zymography에서도 genistein을 투여한 군과 그렇지 않은 군 사이에는 젤라틴 용해능(gelatinolytic activity)에 유의한 차이가 관찰되었다. 72 Kda의 MMP-2 비활성 상태에서는 두 군 사이에 유의한 차이가 없었으나, 62 kDa의 MMP-2 활성 상태에서는 genistein을 투여한 군이 훨씬 낮은 젤라틴 용해능을 보였다.현재까지 정확한 생물학적 기전이 규명되지는 않았으나,이러한 결과들은 genistein이 침습 억제효과(anti-invasive activity)를 가지고 있으며,젤라틴 용해능의 억제가 세포외(extracellular)에서 MMP-2의 분비 이후(post-secretory)에 일어남을 의미하였다.
- 05). 72 kDa인 MMP-2의 비활성 상태에서 두 군사이에 유의한 차이가 없었으나, 62 kDa인 MMP-2의 활성 상태에서는 대조군이 genistein 투여군에 비해 1.8 배 높게 나타났다(p<0.05)(Table 1).
- 4). Densitometric analysis의 결과, VEGF에 관련된 4.5 kb mRNA가 genistein 투여군에서 3.5 배 낮게 나타났다(p<0.05). 이와 다르게, bFGF의 densitometric analysis에서는 두 군 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(p>0.
- Genistein은 구강 편평세포암종 세포주인 HSC-3에 대한 시험관내 실험에서 인공 기저막에대한 세포 수준의 침습을 억제하였고, MMP-2의 젤라틴용해능,특히 활성 상태의 젤라틴 용해능을 저하시켰으며, VEGF mRNA의 발현을 억제하였다.본 실험의 결과만으로 genistein이 구강 편평세포암종에 대한 항암약제로서 유용하다 할 수는 없으나, genistein이 구강 편평세포암 종에 대해 신생혈관화 억제효과와 젤라틴 용해능 억제 효과,즉 침습 억제효과를 통해 항암효과가 있는 것으로 사료되었다.
- 3에서 보는 바와 같이 대조군의 젤라틴용해능은 정상 점막 섬유아세포군의 젤라틴용해능 보다 높았다. MMP-2의 용해능은 대조군과 genistein 투여군 사이에 유의한 차이를 보였다. Genistein 투여군의 총 용해능은 107.
- .구강 편평세포암종의 성장과 신생혈관화에 대한 genistein의 효과를 평가하기 위해,대표적인 신생혈관화 인자인 VEGF와 bFGF의 mRNA 발현에 대해 northern blot analysis를 시행한 결과, VEGF mRNA의 발현은 genistein투여군에서 대조군 보다 유의하게 낮았다.이러한 결과는 tyrosine kinase pathway가 구강 편평세포암종의 신생혈관화를 조절하는 역할이 있음을 시사하였다.
- )에 대한 세포 수준의 침습을 크게 억제하였다.또한, gelatin zymography에서도 genistein을 투여한 군과 그렇지 않은 군 사이에는 젤라틴 용해능(gelatinolytic activity)에 유의한 차이가 관찰되었다. 72 Kda의 MMP-2 비활성 상태에서는 두 군 사이에 유의한 차이가 없었으나, 62 kDa의 MMP-2 활성 상태에서는 genistein을 투여한 군이 훨씬 낮은 젤라틴 용해능을 보였다.
- Genistein은 구강 편평세포암종 세포주인 HSC-3에 대한 시험관내 실험에서 인공 기저막에대한 세포 수준의 침습을 억제하였고, MMP-2의 젤라틴용해능,특히 활성 상태의 젤라틴 용해능을 저하시켰으며, VEGF mRNA의 발현을 억제하였다.본 실험의 결과만으로 genistein이 구강 편평세포암종에 대한 항암약제로서 유용하다 할 수는 없으나, genistein이 구강 편평세포암 종에 대해 신생혈관화 억제효과와 젤라틴 용해능 억제 효과,즉 침습 억제효과를 통해 항암효과가 있는 것으로 사료되었다.
- 구강 편평세포암종의 성장과 신생혈관화에 대한 genistein의 효과를 평가하기 위해,대표적인 신생혈관화 인자인 VEGF와 bFGF의 mRNA 발현에 대해 northern blot analysis를 시행한 결과, VEGF mRNA의 발현은 genistein투여군에서 대조군 보다 유의하게 낮았다.이러한 결과는 tyrosine kinase pathway가 구강 편평세포암종의 신생혈관화를 조절하는 역할이 있음을 시사하였다.
- 또한 genistein이 저밀도의 증식 내피세포(proliferating endothelial cells) 배양시에 25 μM 이하의 농도에서 성장정지(growth arrest)의 소견을 보이며, 25 μM 이상의 농도에서는 세포사(cell death)의 소견을 보이며,따라서 genistein이 약 25 μM 이하의 농도에서는 cytostatic하며 그 이상의 농도에서는 cytotoxic하지만,이와 다르게 정지 내피세포(quiescent endothelial cells)에서는 genistein이 100 μM 의 농도에서도 세포 독성이 나타나지 않았다는 보고도 있었다37).이러한 사실들을 바탕으로, genistein을 항암제제로 사용하는 경우에 다른 경우에 비하여 부작용이 적을 것으로 예상할 수 있으며,이는 본 실험에서 사용된 genistein의 농도 10 μM 에도 적용할 수 있다.이러한 점은 genistein을 치료 목적으로 사용할 수 있는지를 고려할 때 중요하다 하겠다.
후속연구
- Genistein은 구강 편평세포암종에 대한 시험관내 실험에서 VEGF mRNA의 발현을 억제하고 젤라틴 용해능을 감소시키는 항암효과를 보였다.이상과 같은 사실만으로는 genistein을 구강 편평세포암종에 대한 단일한 항암치료 수단으로 인정하기는 어려우나,적어도 genistein을 구강 편평세포암종에 대한 부가 치료수단(adjunct treatment modality)이나 병용요법 제제 (combination therapy agent)로 이용할 수 있는 가능성을 확인하였기에, genistein의 구강 편평세포암종에 대한 항암효과에 대해 생체내 실험을 포함하는 추가적인 연구가 요망된다.
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